杭玉敏

(山西師范大學(xué)教師教育學(xué)院，山西 臨汾 041000)

在生態(tài)系統(tǒng)中，苔蘚的地位是舉足輕重的，在植物界的系統(tǒng)演化過程中具有特殊的地位[1]，它能作為監(jiān)測(cè)空氣污染程度的指示植物。高質(zhì)量的RNA對(duì)生物的研究有很重要的意義，尤其是分子方面，因此，如果能從苔蘚植物組織中分離到質(zhì)量比較好的RNA是順利進(jìn)行一些分子學(xué)研究的助推器。

一、研究目標(biāo)

本研究以不同狀態(tài)的紫萼蘚作為研究對(duì)象，用同一種方法提取RNA，通過檢測(cè)提取出的RNA純度從而對(duì)不同狀態(tài)的紫萼蘚提取情況進(jìn)行比較。

二、研究?jī)?nèi)容

(一)采集紫萼蘚后干燥處理一部分，在培養(yǎng)皿里培養(yǎng)一部分，實(shí)驗(yàn)前將紫萼蘚去根進(jìn)行冷凍過夜處理，同時(shí)也可將研缽進(jìn)行遇冷處理；

(二)取100mg自然生長(zhǎng)新鮮紫萼蘚若干份和90mg干燥處理的紫萼蘚若干份，將以上材料用改進(jìn)的SDS法提取紫萼蘚的總RNA；

(三)將提取出的RNA樣品用DEPC水稀釋20倍，再用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取到的總RNAOD260/OD280比值；

(四)記錄測(cè)量到的總RNA的OD260/OD280比值，通過分析該比值的大小來(lái)說(shuō)明什么狀態(tài)下的紫萼蘚更適合總RNA的提取。

三、方法與步驟

在進(jìn)行以下所有的實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，所用到的所有玻璃器皿和研缽在使用前都要進(jìn)行高壓滅菌；用0.1%的DEPC水浸泡塑料離心管和槍頭，浸泡時(shí)間最低12h，之后再進(jìn)行高壓滅菌。配制好的溶液在進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)操作前也需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，所有實(shí)驗(yàn)過程都要盡量避免外源RNA酶的影響。

改進(jìn)的SDS法提取紫萼蘚RNA

(1)將所需要的全部紫萼蘚進(jìn)行去根處理，置于冰箱冷凍(-24℃)過夜，同時(shí)將研缽也進(jìn)行遇冷處理；(2)制備SDS提取緩沖液；(3)在六個(gè)1.5mL的離心管中先后加入SDS提取緩沖液(500μL)、水飽和酚(300μL)和β-巰基乙醇(100μL)；(4)稱取100mg三份培養(yǎng)皿培養(yǎng)的新鮮紫萼蘚和90mg三份干燥處理的紫萼蘚，取稱量好的紫萼蘚置于研缽中，每份紫萼蘚加100mgPVP研磨成粉末，研磨后迅速加入上述離心管中，每次研磨后用蒸餾水對(duì)研缽進(jìn)行適當(dāng)清洗；(5)分別再在上述每一離心管中加入70%的無(wú)水乙醇(200μL)，再加入KAc(200μL)，適當(dāng)搖勻后在4℃、12000r/min的條件下離心10min；(6)將離心管中的水相分別轉(zhuǎn)移至另外六個(gè)離心管中，加苯酚異戊醇至1.5mL刻度處，混勻后4℃、12000r/min條件離心10min；(7)用塑料吸管吸取水相于另外六個(gè)干凈的離心管中，加NaAc和70%無(wú)水乙醇，-24℃產(chǎn)生沉淀后與以上相同離心條件離心10min，用NaAc(500μL)洗滌沉淀后于相同條件下離心5min；(8)離心后的沉淀轉(zhuǎn)移后加DEPC水溶解，之后再加入NaAc(20μL)和70%的乙醇(500μL)，混勻后-24℃使RNA進(jìn)行沉淀，再進(jìn)行離心15min使其充分沉淀；(9)將所得到的RNA用配制的75%的乙醇洗后，用DEPC的水溶解，-24℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

(一)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取提取出的培養(yǎng)皿培養(yǎng)的新鮮的和干燥處理的紫萼蘚總RNA，用DEPC水稀釋20倍后用紫外分光光度儀測(cè)其OD260/OD280的比值。干燥處理的樣本和培養(yǎng)皿培養(yǎng)的新鮮樣本提取出的總RNA OD260/OD280的平均值分別為1.12和0.97，由此可得：就同一種方法而言，用干燥樣本提取出的RNA OD260/OD280值比培養(yǎng)皿水培培養(yǎng)的新鮮紫萼蘚的值高，因此可推斷同一方法用干燥樣本提取出的RNA純度更高。

(二)結(jié)果分析

用以上方法得到的OD260/OD280比值沒有達(dá)到滿意的效果，其原因可能為：第一、RNA在提出前就已經(jīng)被降解，RNA酶無(wú)處不在，實(shí)驗(yàn)過程中槍頭和離心管雖然用DEPC水浸泡，但是在轉(zhuǎn)移的過程中難免會(huì)有酶污染，研缽和配制好的溶液也會(huì)有RNA酶，實(shí)驗(yàn)過程中最后導(dǎo)致提取出的RNA酶含量很少；第二、有蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)的在實(shí)驗(yàn)后會(huì)有殘留，實(shí)驗(yàn)藥品也會(huì)有殘留；第三、實(shí)驗(yàn)操作過程中研磨后的紫萼蘚不能全部轉(zhuǎn)移到離心管中，導(dǎo)致RNA浪費(fèi)以及實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)的一些不規(guī)范和失誤都會(huì)導(dǎo)致所提取的RNA純度不高。

而根據(jù)結(jié)果可以分析出干燥的紫萼蘚提取出的總RNA質(zhì)量更高些，其原因可能是：第一、研缽體積較大，研磨材料較少，濕的材料比干的材料更容易粘在器皿上；第二、加入PVP螯合劑，干燥的材料能研磨地比較細(xì)致，而新鮮的材料在研磨是水分比較多，這樣會(huì)影響RNA的釋放量；實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)使用一些試劑使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)與RNA分離，而藥品的使用對(duì)干燥材料和新鮮材料作用也是不一樣的。

五、結(jié)束語(yǔ)

苔蘚具有耐旱的特性對(duì)人們?nèi)粘Ｉa(chǎn)生活具有非常重要的意義，但是提取苔蘚RNA過程非常困難，耐旱植物的多酚類物質(zhì)，糖類物質(zhì)等都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，影響其完整性和純度。[2]因此，尋找苔蘚植物的總RNA在一定狀態(tài)下高效提取對(duì)社會(huì)生產(chǎn)有重大意義。

[1]鐘如濤，陳喜英.中國(guó)苔蘚植物研究現(xiàn)狀[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2009，34(5).

[2]劉芳，官春云.富含多酚類植物RNA提取的研究進(jìn)展[J].作物研究，2015，29(1).