利用qPCR法檢測OsPIMT1轉(zhuǎn)基因水稻中的外源片段拷貝數(shù)

魏毅東，羅曦，吳方喜，林悅龍，何煒，連玲，謝華安*，張建福*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州350019；2.農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點實驗室/福州（國家）水稻改良分中心/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國家重點實驗室培育基地/雜交水稻國家重點實驗室華南研究基地/福建省作物分子育種工程實驗室/福建省水稻分子育種重點實驗室，福建福州350003）

植物轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物功能基因研究與作物品種改良。目前常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，由于片段是隨機插入到基因組中，當多個片段重組到基因組中將影響外源基因的表達，甚至?xí)斐赏庠椿虺聊?］，且不利于后續(xù)的遺傳分析。為了獲得單一插入片段的轉(zhuǎn)基因植株，早期的研究人員不得不依賴于費時費力，且需要大量基因組DNA的Southern 雜交法進行拷貝數(shù)鑒定。隨著實時熒光定量 PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）技術(shù)的不斷發(fā)展，其已經(jīng)成為快速、靈敏、高效的拷貝數(shù)鑒定方法。目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)被用于轉(zhuǎn)基因棉花，小麥，玉米等作物的拷貝數(shù)鑒定［2-4］。本研究選取保守的單拷貝基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH2作為內(nèi)參基因［5,6］，利用基于2-ΔCT相對定量法的熒光定量PCR技術(shù)，建立了快速，高效的不依賴于標準曲線的水稻除草劑草銨膦抗性基因的拷貝數(shù)分析體系，從而簡化了轉(zhuǎn)基因水稻拷貝數(shù)鑒定的流程并提高了檢測通量。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒模版：pOE-PIMT1（含有草銨膦抗性基因bar），GAPDH2基因PCR產(chǎn)物和UBQ5基因PCR產(chǎn)物。

水稻材料：秈稻航2號對照，含有bar基因的OsPIMT1轉(zhuǎn)基因克隆，依次命名為AL1～AL9。

1.2 引物設(shè)計與合成

水稻內(nèi)參基因UBQ5，GAPDH2和抗性基因bar的引物使用Primer premier5軟件設(shè)計，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

bar基因：

上游引物：GCACCATCGTCAACCACTAC，

下游引物GTCGTCCGTCCACTCCTG;

GAPDH2基因：

上游引物：AAGCCAGCATCCTATGATCAGATT,

下游引物：

CGTAACCCAGAATACCCTTGAGTTT；

UBQ5基因：

上游引物：ACCACTTCGACCGCCACTACT；

下游引物：ACGCCTAAGCCTGCTGGTT。

1.3 基因組DNA提取

采用CTAB法提取水稻葉片DNA［7］，對提取的DNA進行瓊脂糖電泳以及紫外分光法檢測，保證DNA未降解且無雜質(zhì)污染。

1.4 熒光定量PCR 擴增

實時定量PCR反應(yīng)在96孔板中進行，50 μL反應(yīng)體系包含以下成分：25μL 2× FastStart Universal SYBR Green Master （ROX），上下游引物終濃度各為0.3μM，5μL稀釋的DNA（50 ng/μL）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)ABI7500儀器標準程序進行溶解曲線分析。

1.5 內(nèi)參基因ubc5和外源基因bar標準曲線制作

以含有草銨膦抗性基因bar的質(zhì)粒pOE-PIMT1作為標準品，將其進行5×梯度稀釋，濃度分別為10 pg/μL，2 pg/μL，0.4 pg/μL, 80 fg/μL，16 fg/μL。同時以GAPDH2和UBQ5基因的PCR產(chǎn)物為標準品，稀釋終濃度為0.5 pg/μL，0.1 pg/μL，20 f/μL，4 pg/μL，0.8 fg/μL。

反應(yīng)擴增程序按1.3進行，最后分別制作標準曲線。

1.6 轉(zhuǎn)基因水稻中內(nèi)參基因和外源基因的定量分析

利用已驗證的含bar基因的純合單拷貝株系的gDNA用作參比模版，9個PCR陽性的OsPIMT1轉(zhuǎn)基因克隆植株以及親本航2號的gDNA為待測樣品模板，以內(nèi)參基因與抗性基因的檢測引物進行qPCR 檢測，所得CT值利用2-△△CT法進行定量分析。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交分析

將提取的水稻gDNA利用PstI（Takara）進行酶切（時間6 h，溫度37℃，體積250 μL，gDNA 150 μg）。待酶切結(jié)束后，在酶切體系中加入2.5倍體積冰乙醇和100 μL體積3M NaCl溶液混合后-20℃放置30 min，于16 000 g低溫離心10 min。吸棄去上清后，加入55 μL ddH2O溶解DNA，將溶解的DNA與6μL 10× DNA loading buffer混合后上樣電泳。電泳參數(shù)為：0.7%瓊脂糖，2.5 V/cm電泳8 h左右，直至溴酚藍指示帶跑至底部位置。參照分子克隆第三版［8］，采用毛細管向上轉(zhuǎn)膜法進行DNA印跡，雜交、探針制備和顯色使用AlkPhos Direct Labeling and Detection System （Amersham）進行，操作步驟參照廠家說明書。

1.8 轉(zhuǎn)基因后代的分離比分析

秈稻航2號種子和T1代轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)過1 d浸種后，用濕布包裹于37℃催芽。將發(fā)芽的種子播種到盆土中，待第2片葉完全展開后噴施500 mg/mL草銨膦，5 d后將幼苗取出，統(tǒng)計死亡和存活的幼苗數(shù)量，所得數(shù)據(jù)用SPSS19進行卡方統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量擴增曲線與溶解曲線

3個基因bar，UBQ5和GAPDH2的擴增曲線如圖1所示，結(jié)果表明擴增曲線平滑，擴增穩(wěn)定。同時我們對擴增產(chǎn)物進行溶解曲線測定，bar、UBQ5和GAPDH2基因的Tm值分別為81.8℃，80.5℃，和78.3℃，溶解曲線均為單一峰，說明引物的特異性較強，在反應(yīng)中無引物二聚體等非特異性擴增，適合用于qPCR分析。

圖1 bar, UBQ5, GAPDH2 基因擴增曲線與溶解曲線

2.2 熒光定量標準曲線

以起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)為縱坐標，CT值為橫坐標繪制標準曲線，分別獲得bar，UBQ5和GAPDH2的標準曲線（圖2）。由于2-ΔΔCT對兩個基因的擴增效率要求很高，需要擴增效率一致，而bar基因引物和GAPDH2引物擴增效率相近，約95%，符合實驗要求，因此選取GAPDH2這個內(nèi)參基因用于后續(xù)的拷貝數(shù)分析。

圖2 內(nèi)參基因UBQ5和GAPDH2與外源抗性基因bar的標準曲線

2.3 基于2-ΔΔCT鑒定T0代轉(zhuǎn)基因水稻的拷貝數(shù)

將所提DNA用于熒光定量PCR分析，由于待測樣品為T0代植株，因此其插入位點為雜合型，純合單拷貝對照樣品的RQ值應(yīng)為T0代單拷貝植株RQ值的2倍，而與雙拷貝植株的RQ值相等。通過2-△△CT法將所有樣品與純合單拷貝的參比對照進行比較，結(jié)果表明L1，L2，L4，L5，L6，L8為單拷貝植株，而L3，L7，L9為雙拷貝植株，其余植株為單拷貝轉(zhuǎn)基因植株（圖3）。

圖3 熒光定量鑒定轉(zhuǎn)基因材料拷貝數(shù)

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻southern雜交驗證與分離比分析

從9個轉(zhuǎn)基因克隆中選取5個轉(zhuǎn)基因植株進行Southern雜交拷貝數(shù)驗證，結(jié)果表明L1，L2，L4和L5為單拷貝植株，而L3為雙拷貝植株（圖4），這與qPCR結(jié)果完全一致。為了進一步驗證qPCR所得的拷貝數(shù)結(jié)果，對T1代轉(zhuǎn)基因進行草銨膦篩選，陰性與陽性植株數(shù)量進行卡方分析，單拷貝植株符合1/3分離比，雙拷貝植株符合1/15分離比（表1）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測

表1 轉(zhuǎn)基因水稻后代分離比分析

3 討論與結(jié)論

早期的水稻轉(zhuǎn)化過程中，由于當時基因組測序尚未完成且水稻組培轉(zhuǎn)化的難度較大，需要Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)化事件和拷貝數(shù)分析。隨著基因組測序的技術(shù)的快速發(fā)展，許多植物，包含水稻的全基因組序列都已測序完成，內(nèi)源基因的拷貝數(shù)以及序列結(jié)構(gòu)都已十分明確。利用熒光定量PCR技術(shù)，借助于基因組數(shù)據(jù)選取合適的內(nèi)參基因能夠準確確定轉(zhuǎn)基因作物對的拷貝數(shù)。近年的研究結(jié)果表明，Southern雜交所得的拷貝數(shù)并不準確［9-11］。排除Southern雜交實驗誤差，如Southern雜交中酶切不完全，不同片段轉(zhuǎn)膜效率不同等因素；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化本身存在不確定性，會發(fā)生大量的基因重排或片段重組［12］，可能導(dǎo)致插入位置附近區(qū)域大片段的復(fù)制或部分重組的發(fā)生，因此需要其他方法進一步驗證Southern blot拷貝數(shù)［13］。

此外，由于本研究采用2-△△CT法而不依賴于非標準曲線法，提高了檢測效率和通量，但應(yīng)盡可能排除樣品方面的影響，需要樣品純度較高，擴增體系要相對穩(wěn)定，重復(fù)性好。經(jīng)過2-△△CT法計算，單拷貝，雙拷貝和三拷貝的RQ值應(yīng)該分別為0.5，1.0以及1.5。實際定量過程中，一般單拷貝RQ值在0.25～0.75，雙拷貝RQ值在0.75～1.25，三拷貝為1.25～1.75。因此，對于每個樣品的CT值誤差應(yīng)當控制在0.25以內(nèi)，否則結(jié)果難以確定。雖然本研究選用了bar基因進行檢測，但只要更換外源基因引物即可檢測潮霉素抗性基因HPTII，新霉素抗性基因NPTII等多種抗性基因。

［1］ Stam,M.，J.N.Mol，J.M. Kooter, Review article：the silence of genes in transgenic plants［J］．Annals of Botany，1997，79（1）：3-12.

［2］ 李淑潔，張正英．REAL-TIME PCR方法測定轉(zhuǎn)基因小麥中外源基因拷貝數(shù)［J］．中國生物工程雜志，2010，30（3）： 90-94.

［3］ 楊曉杰，劉傳亮，張朝軍，等．不同轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花外源基因拷貝數(shù)分析［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（2）：221-229.

［4］ Shepherd,C.T.，A.N.M. Lauter，M.P. Scott，Determination of transgene copy number by real-time quantitative PCR［J］. Transgenic Maize： Methods and Protocols，2009 ：129-134.

［5］ 魏毅東，陳玉，郭海萍，等．水稻缺素脅迫下實時熒光定量 RT-PCR 的內(nèi)參基因的選擇［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（11）：1302-1312.

［6］ Jain,M.，A. Nijhawan，A.K.Tyagi，et al. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR［J］．Biochemical and biophysical research communications,2006，345（2）： 646-651.

［7］ Porebski,S.，L.G.Bailey, B.R. Baum，Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components［J］．Plant molecular biology reporter, 1997，15（1）： 8-15.

［8］ DY, J. and M. Li，Molecular Cloning-A Laboratory Manual（分子克隆實驗指南）. 2002，2nd，Beijing： Science Press.

［9］ Ingham,D.J.,S. Beer，S. Money, et al. Quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants［J］．Biotechniques, 2001，31（1）：132-141.

［10］ Livak, K.J.，T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔCT method［J］．methods, 2001，25（4）： 402-408.

［11］ Faize，M，L. Faize, L. Burgos, Using quantitative realtime PCR to detect chimeras in transgenic tobacco and apricot and to monitor their dissociation［J］. BMC Biotechnol, 2010，10：53.

［12］ Jeon，J.S，S. Lee, K.H. Jung, et al. T‐DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice［J］．The Plant Journal，2000，22（6）： 561-570.

［13］ Mason，G.，P. Provero, A.M. Vaira, et al. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR［J］．BMC biotechnology，2002，2（1）：20.