王娜泠，胡則輝，卞光明，柴學(xué)軍

(1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所,浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江舟山 316021;2.江蘇省射陽縣長蕩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,江蘇鹽城 224322)

隨著環(huán)境的變化,水生動物面臨著遺傳多樣性缺失、物種多樣性枯竭等困境,對物種的快速檢測、精準(zhǔn)鑒定是保護水生動物多樣性及其種質(zhì)資源可持續(xù)利用的前提[1]。傳統(tǒng)分類學(xué)主要依靠形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)特征,受限于研究者經(jīng)驗、研究手段及研究對象形態(tài)近似等局限,難以快捷、有效地對水生動物進行精準(zhǔn)分類,而DNA條形碼技術(shù)利用生物一段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列對生物條形碼掃描即可識別物種,操作簡便、鑒定快速準(zhǔn)確、自動化水平高,對保護生物學(xué)和生物多樣性研究具有重要意義[2-6]。

1 DNA條形碼技術(shù)

1.1 DNA條形碼技術(shù)發(fā)展歷程

DNA條形碼(DNA Barcoding)首先由HEBERT,et al[7]于2003年提出,即利用足夠多的變異及已擴增的較短標(biāo)準(zhǔn)DNA序列片段,在生物種內(nèi)特異性與種間多樣性建立新的身份識別系統(tǒng),從而快速、高效識別物種[8],隨后HEBERT,et al[7]發(fā)現(xiàn)線粒體細胞色素氧化酶亞基I(cytochrome c oxidase I,COI)基因序列差異能夠有效區(qū)分研究物種,提出建立以COI基因5'端648 bp序列多樣性為基礎(chǔ)的條形碼鑒定系統(tǒng)。2004年,美國國立生物技術(shù)信息中心(National Biotechnology Information Center of the United States,NCBI)與生命條形碼聯(lián)盟(Consortium for the Barcode of Life,CBOL)合作將物種條形碼標(biāo)準(zhǔn)DNA序列以及相關(guān)數(shù)據(jù)存儲于GenBank中。隨著2009年國際生命條形碼計劃實施,一個基于所有真核生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫自動鑒定系統(tǒng)逐步建立,截止2017年4月,生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Barcode of Life Data Systems,BOLD)數(shù)據(jù)庫(http：//www.barcodinglife.org/)已經(jīng)收錄超過538萬條DNA條形碼序列,其中正式記述動物物種17.7萬個。此外,信息技術(shù)的發(fā)展為海量數(shù)據(jù)的處理提供了基礎(chǔ),推動了DNA條形碼技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用,生命條形碼協(xié)會和國際生命條形碼計劃還建立了許多針對各類群的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,如ABBI(All Birds Bar coding Initiative)(http：//www.barcodingbirds.org/)、All-Leps(All Lepidopterans)(http：//www.lepbarcoding.org/)、WoRMS(World Register of Marine Species)(http：//www.marineSpecies.org/)等。

1.2 DNA條形碼技術(shù)原理及特征

DNA條形碼是由DNA序列4種堿基(A、T、G、C)不同的排列順序構(gòu)成,每個位點均有4種選擇,該生物特有的DNA條形碼標(biāo)簽,即15個位點便能夠產(chǎn)生415種編碼方式,是地球上現(xiàn)存生物物種數(shù)的10～100倍[9]。由于某些位點堿基受選擇壓力保持不變,可只考慮蛋白質(zhì)編碼基因,依據(jù)密碼子的簡并性,45個位點便可以形成10億種不同序列。即使目前的一代測序技術(shù),也能夠精準(zhǔn)的檢測一段幾百bp長度的DNA序列,故而,在理論上這段648 bp的DNA條形碼足以鑒定所有物種。

作為DNA條形碼基因區(qū)域應(yīng)具備以下幾個特征[10]：①積累足夠多的變異,種內(nèi)變異小,種間變異程度大,能夠區(qū)分不同物種;②目標(biāo)基因區(qū)具備相對保守性,便于引物通用性強,擴增成功率高;③必須是標(biāo)準(zhǔn)DNA片段,能夠最大程度鑒別不同的分類群;④包含足夠多的系統(tǒng)進化信息,能夠精準(zhǔn)地定位物種在分類系統(tǒng)中位置;⑤目標(biāo)片段足夠短,一個反應(yīng)完成測序最佳,滿足部分受損DNA樣本擴增以及序列分析。鑒于以上條件,線粒體COI基因是水生動物分類和鑒定的理想DNA條形碼區(qū)。主要是因為線粒體COI基因不含內(nèi)含子,屬于編碼蛋白基因,能夠通過翻譯檢測錯誤,幾乎不發(fā)生重組、插入以及缺失等現(xiàn)象;其次,900 bp左右的蛋白編碼基因(COI、Cyt b、ND4、ND5)中,COI基因進化速率適中,不會因為進化速率過快引起堿基二次突變而不能夠區(qū)分遠緣物種,幾乎在所有動物種類COI基因5'端都能夠找到作為擴增引物的通用序列[11],并且一般情況下水生動物的COI基因種間變異程度大于種內(nèi)變異,HEBERT,et al[12]分析比較動物界11門13 320種親緣關(guān)系較近同屬物種的COI基因序列,發(fā)現(xiàn)種內(nèi)差異多小于1%、極個別大于2%,而種間差異甚至高達11%以上,種內(nèi)與種間差異之間存在形成明顯的間隔區(qū),是評價DNA條形碼的重要指標(biāo);此外,相比較核基因以及其他蛋白基因,COI基因具有更多系統(tǒng)發(fā)育信息,更適合親緣關(guān)系近的物種分類。故而,通常選用COI基因作為DNA條形碼區(qū),對于個別不能有效鑒定的物種,可使用其他基因片段輔助標(biāo)記鑒別。

1.3 DNA條形碼技術(shù)開發(fā)與分析

DNA條形碼開發(fā)主要包括以下幾個流程：首先,采集具有代表性、覆蓋面廣的群體樣品,記錄采集時間與位置,冷凍保存樣品并提取樣品DNA;然后設(shè)計引物對目的DNA進行PCR擴增,選擇電泳條帶清晰單一產(chǎn)物,進行DNA直接測序或連接質(zhì)粒載體克隆測序;再次觀察測序峰圖,并對所得序列進行比對、人工校正,并通過MEGA、DNAsp等軟件分析比較不同分類階元的遺傳距離(Kimura-2-parameter distance),構(gòu)建Neighbour-jioning(N-J)或UPGMA系統(tǒng)樹以及分析基因流情況等;最后將樣品名稱、DNA條形碼、采集日期地點以及采集人員等樣品數(shù)據(jù)提交至相關(guān)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(BOLD、ABBI、All-Leps以及WoRMS等)。流程圖如圖1。

1.4 DNA條形碼技術(shù)優(yōu)越性

生物表型特征具有一定可塑性,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對物種鑒定時易出現(xiàn)錯誤,而且此方法過于依賴分類學(xué)專家的識別能力,易忽略許多生物類群眾普遍存在的隱存分類單元,形態(tài)檢索表只能夠與鑒別物種特定發(fā)育階段相對應(yīng),無法對鑒定物種進行精準(zhǔn)地識別,制約了生物多樣性的研究。與之相比,DNA條形碼技術(shù)具有以下優(yōu)勢：①對樣品要求低,沒有器官、組織特異性和完整性要求,微克級樣品量、毛發(fā)、甚至某些死亡后的組織等均可提取DNA;②可利用生物DNA序列的穩(wěn)定性與特異性,避免表型差異引起的鑒別錯誤,能夠有效地鑒別形態(tài)差異微小的物種[10];③同一個體的DNA條形碼序列在不同的生長階段不會發(fā)生變化,這能夠克服同一個體不同發(fā)育階段表型差異顯著而引起的誤差,降低了鑒別工作量;④不同類群生物因生存環(huán)境等相似易出現(xiàn)表型特征相似、趨同進化現(xiàn)象,DNA條形碼技術(shù)能夠克服表型類似,從而鑒別出新種、隱存種,增加鑒定工作的準(zhǔn)確性[13];⑤DNA條形碼由四種堿基構(gòu)成,表述明確,有效避免了因研究者語言表述不準(zhǔn)確造成的歧義,且數(shù)據(jù)信息易于數(shù)據(jù)化管理,檢索方便準(zhǔn)確,能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模、高通量鑒定工作,推動物種鑒定以及進化研究的快速發(fā)展。兩種分類方法主要特征比較見表1。

圖1 DNA條形碼開發(fā)流程圖Fig.1 Process of DNA barcode development

表1 DNA條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)分類法特征比較Tab.1 Comparison of DNA barcode technology and traditional taxonomy

2 DNA條形碼技術(shù)在水生動物中應(yīng)用

2.1 魚類

目前,BOLD數(shù)據(jù)庫中收錄的魚類DNA條形碼大多來自COI基因,對魚類進行分類鑒定、隱存種的發(fā)掘、系統(tǒng)發(fā)生研究等方面具有較大的應(yīng)用價值。在國外,線粒體COI基因作為DNA條形碼在淡水魚(鯉魚、鯽魚、羅非魚等)的物種鑒定中取得較好成效[14-20]。值得一提的是,CHAKRABORTY,et al[21]打破DNA條形碼長片段(約600 bp)的常規(guī),通過對1 367個線粒體COI基因序列(154 bp)分析,成功地界定了淡水魚類中3個不同物種,發(fā)現(xiàn)該區(qū)域能夠作為淡水魚的物種特異性微型條形碼。國外海水魚類中,DNA條形碼除了用于物種鑒別[22-23]之外,還用于對隱存種的發(fā)掘、系統(tǒng)發(fā)生研究等方面的研究[24-26]。隨著生物分子學(xué)技術(shù)的發(fā)展,DNA條形碼不再局限于線粒體COI基因,CHANG,et al[27]基于Cyt b片段有效地識別了臺灣本土鰭刺類海水魚類,并建立相關(guān)物種條形碼參考數(shù)據(jù)庫。FERNANDES,et al[28]利用線粒體COI和Cyt b作為條形碼,將DNA微條形碼與高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù)相結(jié)合,成功地鑒別了大西洋鱈魚Gadus morhua、太平洋鱈魚G.macrocephalus、阿拉斯加鱈魚Theragra chalcogramma以及綠鱈。在DNA條形碼技術(shù)較為成熟的基礎(chǔ)上,BAMANIYA,et al[29]開發(fā)了31種印度重要的商業(yè)海洋觀賞魚DNA條形碼。

在國內(nèi),魚類線粒體COI基因被廣泛用于DNA條形碼的有效性驗證及作為DNA條形碼進行分類鑒別(表2)。當(dāng)然,國內(nèi)DNA條形碼技術(shù)也不局限于線粒體COI基因。陳文炳等[30]利用線粒體16S rRNA基因進行鰻魚的鑒定,成功檢測出大量樣品。陳文炳等[31]利用線粒體細胞色素b基因建立河豚魚物種DNA鑒別技術(shù),也證明了其可行性。

表2 國內(nèi)基于線粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)在魚類中的應(yīng)用Tab.2 The application of DNA barcoding technology on mitochondrial COI gene of fish in China

2.2 甲殼類

甲殼類DNA條形碼研究相對魚類更為完善,毋庸置疑線粒體COI基因被證明是理想的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[39-42],也有學(xué)者嘗試用其他區(qū)域基因作為DNA條形碼對甲殼動物進行有效性驗證,原帥等[43]測定了藤壺科線粒體COI、16S和12S的部分序列,并充分利用GenBank中藤壺科其它物種的相關(guān)基因序列,對其進行可行性和有效性鑒別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體COI基因能更準(zhǔn)確地鑒定藤壺科種間以及種內(nèi)關(guān)系。

在小型甲殼動物橈足類物種中,BLANCOBERCIAL,et al[44]對63種橈足類物種的800條新條形碼序列進行分析,并根據(jù)195個橈足類物種的1 381個條形碼序列的數(shù)據(jù)集,檢查了不同統(tǒng)計學(xué)方法對物種鑒定的可靠性和分辨率,發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)在橈足類物種識別中具有重要價值,實現(xiàn)了DNA條形碼高通量的應(yīng)用。BTTGER-SCHNACKET,et al[45]對COI基因和12S基因比較分析,推測12S基因可能更適合作為DNA條形碼對隆劍水蚤科進行有效鑒定。

90多種磷蝦目中,由于其細微的形態(tài)特征及幼體的發(fā)育特征給鑒定帶來極大的挑戰(zhàn)。線粒體COI基因仍然能夠作為DNA條形碼對其進行物種鑒定、隱存種的發(fā)現(xiàn)及系統(tǒng)地理學(xué)方面的研究[46]。

2.3 貝類

貝類屬于軟體動物,目前國際上對貝類DNA條形碼研究報道較少。大量利用DNA條形碼對魚類、甲殼類水生動物進行物種鑒定、隱存種的發(fā)掘等方面的研究啟發(fā)了學(xué)者們利用同樣的方法對形態(tài)相似、種類繁多的貝類進行鑒定。研究者們發(fā)現(xiàn)線粒體COI基因能夠有效地對寶貝科Cypraeidae[47]、帽貝Lepetodrilus limpets[48]、雙殼類[49]、四角蛤蜊 Mactra veneriformis[50]、蚌類[51]、綴錦蛤亞科 Tapetinae[52]、頭足類[53]、貽貝科Mytilidae[54]、異齒亞綱[55]、骨螺科Muricidae和織紋螺科Nassariidae[56]等貝類進行物種鑒定。也有研究利用線粒體16S r RNA基因?qū)ω愵愡M行種類鑒定,李海濤等[57]采用DNA條形碼技術(shù)對部分形態(tài)上難以鑒定的種類,如線縫摺塔螺Ptychobela suturalis和區(qū)系螺Funa sp.、鋸齒巴非蛤Paphia gallus、西格織紋螺Nassarius siquijorensis、爪哇擬塔螺Turricula javana等,結(jié)果表明,DNA條形碼技術(shù)能有效提高海洋貝類物種鑒定的準(zhǔn)確性并發(fā)現(xiàn)隱存種。

2.4 其它水生動物

在其他水生動物中也有一些關(guān)于DNA條形碼的報道。陳海燕[58]利用DNA條形碼技術(shù)分析巖礁海藻附植動物,結(jié)果表明,鼠尾藻附植動物的年平均豐度、類群數(shù)、生物量均高于其他海藻附植動物,海藻附植動物的優(yōu)勢類群在不同月份和不同海藻之間均存在差異。律迎春[59]基于COI基因作為DNA條形碼分析海參群體,發(fā)現(xiàn)海參的種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離,同種海參不同個體在系統(tǒng)樹種分別形成各自獨立的分支。辛翠娜等[60]對采自中國海南、廣東、云南以及緬甸的4科7個種18個龜鱉類個體的COI序列進行分析,證實了線粒體COI序列能夠作為DNA條形碼對龜鱉類進行物種鑒定。此外,張珰妮等[61]以COI和16S rRNA基因作為DNA條形碼對北部灣北部的28種水螅水母進行了有效地物種鑒定。

3 展望

DNA條形碼技術(shù)促進了水生動物分類研究,但若成為準(zhǔn)確的分析手段還需進一步完善：首先,若研究的物種種內(nèi)種間遺傳差異較小,種內(nèi)分化過高或種間分化較低,物種間界定不顯著,則無法通過DNA條形碼技術(shù)對物種進行準(zhǔn)確鑒別[62];其次,DNA序列中存在假基因——非同義突變、提前出現(xiàn)終止密碼子以及基因插入缺失等也會影響DNA條形碼鑒定效果,SONG,et al[63]研究小龍蝦假基因?qū)NA條形碼鑒定的影響,發(fā)現(xiàn)假基因能夠引起DNA條形碼技術(shù)過高估計物種數(shù)目,在支系中存在特異性分布,無法完全剔除全部假基因;再次,通用引物獲取難度較大,目的片段的獲得需要利用大約20 bp長度的引物進行PCR擴增獲得,獲取合適的引物需要對物種的某區(qū)域基因深入了解,根據(jù)目、科、種、屬逐級查找最合適條形碼,而生物核基因、細胞器基因等不同DNA基因區(qū)段進化速率差異顯著,難以找到某DNA序列來鑒定地球上所有水生動物,COI基因序列進化速率與物種所處的分類階段都不是絕對對應(yīng),難以實現(xiàn)對水生動物進行完全鑒定,尤其對于多樣性較高的熱帶物種[64];此外,許多實驗研究取材數(shù)量較少,易低估種內(nèi)差異,或沒有考慮姊妹群而高估種間差異[65],對于普遍存在的共生、寄生物種,由于二者DNA提取分離難度較大,使得通用DNA條形碼難以實現(xiàn)物種的有效區(qū)分。故而,進一步優(yōu)化DNA提取方法、開發(fā)DNA條形碼芯片、完善“微型條形碼”鑒定技術(shù)、通過具體實踐有針對性解決上述局限是DNA條形碼發(fā)展的方向。

全面深入分清待分類物種的形態(tài)學(xué)特征是DNA條形碼研究正確取樣的前提[66],而DNA條形碼是分類學(xué)新的發(fā)展動力,是電子技術(shù)便攜性與信息存儲功能的綜合產(chǎn)物,能夠分析物種分支來源、模擬物種進化趨勢[67]。在傳統(tǒng)分類學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展出的DNA條形碼技術(shù),在與生物識別的DNA條形碼相結(jié)合時發(fā)展出的高通量條形碼技術(shù)(Metabarcoding),通過這些技術(shù)有機結(jié)合,將能夠?qū)崿F(xiàn)物種更加精準(zhǔn)、科學(xué)地鑒別效果。

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