史宏志，楊惠娟，王俊，張夢(mèng)玥，任夢(mèng)娟

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002

1 背景及意義

生物堿是煙草屬（Nicotiana）植物的重要化學(xué)成分，其中煙堿是普通煙草屬最主要的生物堿，約占總生物堿的90%以上[1]。人們?cè)谖碂熑~過程中，煙堿通過血液進(jìn)入腦細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生生理反應(yīng)，因此被認(rèn)為是煙葉中主要的生理活性成分，其含量高低不僅決定了煙葉的生理強(qiáng)度，也是煙草制品產(chǎn)生致癮性的主要成分[2]。Benowitz等（1994）[3]首先提出把煙葉煙堿含量降低到使人致癮的臨界值以下可以有效減少吸煙者對(duì)煙草的依賴性的理念，此后人們針對(duì)低煙堿卷煙對(duì)吸煙行為和致癮性的影響開展了一系列的研究工作[4-6]。美國食品和藥品管理局(FDA)宣布，有可能強(qiáng)制降低可燃香煙中的煙堿含量，將可燃香煙中的煙堿含量降低到不使人致癮的水平（0.17毫克/克）[7]。為了降低吸煙率，世界衛(wèi)生組織（WHO,2015）[8]建議將卷煙煙絲中的煙堿含量降至0.4毫克/克以下。因此，低煙堿含量煙葉生產(chǎn)技術(shù)的可行性和對(duì)煙葉品質(zhì)及消費(fèi)者感受的影響成為近幾年國際煙草界的研究熱點(diǎn)，其研究結(jié)果將對(duì)卷煙煙絲煙堿含量控制政策的制定和控制措施的實(shí)施產(chǎn)生重要影響。

2 低/超低煙堿煙葉生產(chǎn)途徑及特點(diǎn)

煙葉的煙堿含量從根本上來說受遺傳因素控制，但受到生態(tài)、農(nóng)藝等措施的強(qiáng)烈影響。目前低煙堿煙葉的生產(chǎn)技術(shù)包括常規(guī)育種、遺傳工程、農(nóng)藝調(diào)控及化學(xué)萃取等。

2.1 常規(guī)育種

煙草基因資源中存在一定的低煙堿材料，但這些材料一般農(nóng)藝性狀較差，無栽培利用價(jià)值，用其進(jìn)行低煙堿品種培育需要長達(dá)10年以上的選擇，而且即使育成農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀優(yōu)良的栽培品種可能其生物堿含量也很難達(dá)到所推薦的低于0.04%的推薦標(biāo)準(zhǔn)。世界低煙堿品種培育始于上世紀(jì)60年代，Legg等（1969; 1971）[9-10]將一種古巴雪茄煙低生物堿材料與白肋煙（Burley21）雜交，然后進(jìn)行12輪回交，得到低生物堿含量的白肋煙純系。將其與正常白肋煙雜交、回交并對(duì)F1、F2和回交世代的分離情況進(jìn)行分析得出，生物堿由兩個(gè)獨(dú)立的基因位點(diǎn)控制，這兩個(gè)位點(diǎn)分別定義為Nic1和Nic2。正常高煙堿含量的白肋煙基因型為雙顯性，即Nic1Nic1Nic2Nic2，低生物堿基因型為純和隱形nic1nic1nic2nic2。Legg and collins通過雜交獲得了全部可能的9種近等系，通過計(jì)算比較兩個(gè)基因位點(diǎn)的純合子生物堿含量的差異，可以得出Nic1和Nic2兩個(gè)位點(diǎn)的劑量效應(yīng)為Nic1=2.4Nic2，控制煙堿合成兩個(gè)基因均為雙隱性的低煙堿品系LAB21的煙堿含量可低至3.0mg/g。人們已通過雜交、回交和雙倍體培養(yǎng)還培育出具有不同Nic1,Nic2顯隱性組合的烤煙（如NC95、Coker139、SC 58）和深色晾煙（如KY171）品系，包括低生物堿品系（LA）、中低生物堿品系（LI）、中高生物堿品系（HI）和高生物堿品系（HP）[10-11]。低生物堿品系總生物堿含量從正常的15-45 mg/g降至2.0-4.5 mg/g，與高生物堿品系相比煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿四種主要生物堿含量均顯著下降。在煙葉生物堿含量降低的同時(shí)，根系有關(guān)生物堿合成關(guān)鍵控制酶類如腐胺甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(QPT)、二胺氧化酶（DAO）、天冬氨酸脫羧酶（ADC）、鳥氨酸脫羧酶（ODC）等活性及SAMS mRNA表達(dá)水平等都顯著下降[12-16]。這表明雙隱性的低煙堿品系的整個(gè)生物堿合成途徑受到了系統(tǒng)性的抑制，煙堿及其它生物堿的合成能力都同步降低。綜合來看，通過常規(guī)育種雖然可大幅度降低煙葉煙堿含量，但進(jìn)一步培育超低水平煙堿含量煙草品種的潛力較小。

煙堿可在煙堿去甲基酶作用下脫去甲基可轉(zhuǎn)化為降煙堿，通過培育具有煙堿去甲基酶活性的煙堿轉(zhuǎn)化型品系是獲得低煙堿煙葉的另外一條途徑。目前已知控制煙堿轉(zhuǎn)化的基因?yàn)镃YP82E4[17-19]，可賦予煙葉煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化能力，該基因主要在煙葉衰老過程中表達(dá)，可受乙烯利和碳酸氫鈉誘導(dǎo)[20-21]。通過系統(tǒng)選擇可以獲得高轉(zhuǎn)化能力的轉(zhuǎn)化株，具有高轉(zhuǎn)化能力的轉(zhuǎn)化株通過乙烯利誘導(dǎo)可使煙葉煙堿轉(zhuǎn)化率達(dá)95%以上。但通過這一途徑降低煙堿含量的同時(shí)會(huì)造成降煙堿含量的大幅增高，而降煙堿又是煙草中主要的煙草特有亞硝胺之一亞硝基降煙堿（NNN）的直接前體物，由于降煙堿屬于仲胺類生物堿，比叔胺類的煙堿更容易發(fā)生亞硝化反應(yīng)，導(dǎo)致煙葉總TSNA水平上升[22]。而且有研究表明，降煙堿具有致癮性[23]，在含量較低時(shí)也可強(qiáng)化煙堿的致癮性[24-25]。因此，通過煙堿去甲基培育低煙堿品種的途徑并不具有現(xiàn)實(shí)可行性。

2.2 遺傳工程

通過分子手段抑制或敲除煙堿合成的關(guān)鍵基因可以有效降低煙堿合成，使煙葉煙堿含量降至極低的水平。煙堿由一個(gè)吡啶環(huán)和一個(gè)甲基吡咯環(huán)組成，二者均由相關(guān)氨基酸等初生代謝產(chǎn)物經(jīng)獨(dú)立的生物合成途徑而形成，最后二環(huán)連接形成煙堿；新煙草堿是由兩個(gè)吡啶環(huán)連接形成，均通過煙酸合成途徑而來；假木賊堿是由吡啶環(huán)和六氫吡啶組成，吡啶環(huán)亦來自煙酸，六氫吡啶則是由賴氨酸經(jīng)尸胺轉(zhuǎn)化而來；降煙堿一般認(rèn)為是由煙堿去甲基轉(zhuǎn)化形成，但也不排除通過吡啶環(huán)和吡咯環(huán)的直接連接合成[1]。因此，煙葉中主要的四種生物堿含有一個(gè)共同的吡啶環(huán)，另一個(gè)環(huán)卻來源不一。這些吡啶類生物堿雙環(huán)的縮合可能具有共同的機(jī)制，Shi et al (1999)[26]采用3H同位素標(biāo)記的煙酸進(jìn)行飼喂和薄層色譜法分離生物堿等方法研究了添加不同濃度生物堿前體物（3H-煙酸、甲基腐胺、尸胺等）對(duì)生物堿合成的影響。結(jié)果表明，增加甲基腐胺濃度可顯著增加3H煙堿合成，同時(shí)3H假木賊堿和新煙草堿合成顯著降低，添加煙酸和尸胺可顯著增加假木賊堿合成同時(shí)抑制新煙草堿合成，而單獨(dú)添加尸胺在增加假木賊堿合成的同時(shí)，可抑制煙堿和新煙草堿的合成，表明不同生物堿存在相同的生物合成機(jī)制，相互之間存在競爭關(guān)系。近期研究表明，小檗堿橋狀酶(BBL)基因參與了生物堿合成的最后步驟[27]。煙堿在根系合成后通過木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部莖葉組織，并在細(xì)胞液泡中積累。經(jīng)過過去20多年大量研究，生物堿合成的代謝過程更加清晰，特別是關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)和控制基因逐漸被揭示和認(rèn)識(shí)[28]，這為通過基因工程有效調(diào)控生物堿合成、運(yùn)輸和積累提供了可能，并成為近些年來控制煙葉煙堿含量和超低煙堿材料創(chuàng)制的主要途徑。目前通過生物堿合成的關(guān)鍵基因及分子調(diào)控機(jī)制開展煙堿遺傳工程的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：

腐胺甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因：PMT催化腐胺甲基化形成甲基腐胺，這是煙堿特有的甲基吡咯結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵步驟，PMT基因表達(dá)水平直接影響煙堿合成[13,29]。通過轉(zhuǎn)基因手段下調(diào)林煙草（N.sylvestris）PMT基因表達(dá)水平，煙堿合成大幅度減少，但表現(xiàn)出葉片生長和開花異常[30]，他們認(rèn)為煙株發(fā)育受到影響可能是因?yàn)楦泛投喟返姆e累所致，或者是由于吡啶環(huán)合成途徑中一些與生長有關(guān)的中間產(chǎn)物過多積累引起的。Chintapakorn等 (2003)[31]采用反義技術(shù)下調(diào)栽培煙草根系PMT基因表達(dá)，在其酶活性顯著降低的同時(shí)，煙堿含量比對(duì)照大幅降低。利用共抑制（co-suppression）、反義( antisense)或RNA干擾（RNAi ）等技術(shù)抑制PMT基因表達(dá)均可大幅降低煙堿合成[31-33]。

甲基腐胺氧化酶(MPO)基因：該基因編碼催化甲基腐胺氧化酶的形成，這是煙堿甲基吡咯結(jié)構(gòu)合成途徑的第二步反應(yīng)，包括甲基腐胺氧化脫氨形成4-甲氨基丁醛（4-methylaminobutanal）[34-35]。Shoji等（2008）[36]采用基因沉默技術(shù)使培養(yǎng)的煙草根系MPO不表達(dá)可使煙堿合成大幅降低，但同樣，在煙堿含量降低的同時(shí)，新煙草堿含量表現(xiàn)增加，并成為最主要的生物堿。

喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(QPT) 基因：QPT催化喹啉酸進(jìn)入包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在內(nèi)的吡啶核苷循環(huán)，并形成煙酸。通過抑制該酶基因表達(dá)可成功抑制煙堿合成，降低煙堿含量，但煙葉正常生長會(huì)受到顯著影響[37]，因?yàn)樵撁冈跓熑~基礎(chǔ)代謝中至關(guān)重要，其作為煙堿合成調(diào)控目標(biāo)基因的局限性較大。

A622酶基因： A622是屬于PIP家族依賴于NADPH的還原酶，與煙堿中吡啶環(huán)的形成密切相關(guān)，催化煙酸進(jìn)一步形成吡啶環(huán)的中間產(chǎn)物[38-39]。抑制編碼該酶合成的基因可導(dǎo)致煙酸的大量積累，影響煙葉的正常生長。

小檗堿橋狀酶(BBL)基因：該基因家族是近年新發(fā)現(xiàn)的編碼在煙堿合成中起重要作用的小檗堿橋狀酶，該酶是一種含有核黃素的氧化酶，參與在煙堿合成最后步驟，即吡啶環(huán)和吡咯環(huán)連接環(huán)節(jié)的氧化反應(yīng)。通過基因工程手段抑制編碼該酶的基因表達(dá)可顯著降低煙葉煙堿含量[27]。Lewis等(2015)[40]采用RNA干擾技術(shù)沉默BBL基因，育成含有RNAi 構(gòu)件的雙倍體K326轉(zhuǎn)基因煙草品系，并在大田條件下研究了該品系降低煙堿含量的效果。結(jié)果表明，該品種煙葉煙堿含量0.684%, 比正常K326對(duì)照的2.454%大幅降低。為了避免轉(zhuǎn)基因煙草應(yīng)用的限制，他們又采用EMS誘變方法獲得了3個(gè)BBL基因突變體，大田試驗(yàn)表明，具有不同純合子組合的突變系其生物堿含量變幅很大，三重敲除的基因型煙堿含量最低，比對(duì)照降低13倍之多。由于BBL基因控制煙堿合成的最后反應(yīng)，因此作為目標(biāo)基因?qū)ζ湟种撇恢掠谠斐蓪?duì)基礎(chǔ)代謝的影響，是比較理想的調(diào)控位點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

煙堿根葉轉(zhuǎn)運(yùn)基因：通過抑制根系合成的煙堿向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)降低煙葉煙堿積累也是實(shí)現(xiàn)低煙堿煙葉生產(chǎn)的有效途徑。使煙株維持煙堿合成能力有助于保持煙株正常生理代謝，從而保證煙株正常生長和成熟，煙葉質(zhì)量性狀也可得到保障。煙堿合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)有多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與，目前鑒定的煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有 MATE1 、MATE2[41]、JAT1[42-44]、NUP1等[45]。Frederick等（2016）[46]篩選了根系可正常合成煙堿但葉片中含量極低的兩個(gè)野生種N.alata和N.otophora，應(yīng)用RNA-seq對(duì)普通煙草和這兩個(gè)非煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)型煙草進(jìn)行基因表達(dá)比較，觀察和鎖定了一些在普通煙草根系中高表達(dá)但在N.alata或N.otophora中不表達(dá)的基因。利用RNA干擾技術(shù)以普通煙草品種窄葉Madole為材料對(duì)23個(gè)鎖定基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，一些基因的下調(diào)導(dǎo)致煙葉中生物堿含量不同程度的下降，至少3個(gè)基因與煙堿由根向葉的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，可用于低煙堿品系的培育。

2.3 農(nóng)藝手段

通過農(nóng)藝措施調(diào)控根系和煙株生長發(fā)育或與生物堿合成、運(yùn)輸和積累有關(guān)的特定生理代謝過程可以顯著影響煙葉煙堿含量。在常規(guī)栽培措施中，減少氮素施用量、增加單株留葉數(shù)、增加灌水量、提早采收期、推遲打頂和不打頂?shù)却胧┒伎娠@著降低煙葉煙堿含量，但這些措施降低煙堿含量的潛力和幅度相對(duì)較小，而且煙葉煙堿含量的降低往往伴隨著產(chǎn)量和質(zhì)量的顯著下降。

植物激素和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)煙葉生長發(fā)育和次生代謝有顯著影響，化學(xué)調(diào)控可以顯著影響生物堿合成代謝?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為生長素、赤霉素、乙烯、脫落酸、茉莉酸等都參與煙堿的合成和調(diào)控，其中生長素、赤霉素、乙烯是煙堿合成的負(fù)調(diào)控因子，茉莉酸、脫落酸、BR等是煙堿合成的正調(diào)控因子[47-48]。生長素類物質(zhì)可顯著抑制煙堿合成，降低煙葉煙堿含量。煙草打頂以后，用生長素和 2,4-D 等類生長素處理后，可以降低煙堿含量[49-51]，可能是 IAA 濃度的增加向煙株根系傳遞了終止合成煙堿的信號(hào)。打頂后結(jié)合涂抹生長素2,4-D可減少傷害誘導(dǎo)的煙堿合成[2,52-53]。乙烯對(duì)煙堿合成具有明顯的抑制作用，且與生長素和激動(dòng)素抑制煙堿合成的機(jī)理不同[54]。乙烯對(duì)煙堿合成的抑制可能與S-腺苷甲硫氨酸是二者的共同合成前體有關(guān)。另有報(bào)道，丙二酸可以明顯降低煙葉的煙堿含量[55-56]，可能與丙二酸抑制煙株體內(nèi)硝酸還原酶活性有關(guān)。采用化學(xué)調(diào)控措施降低煙葉生物堿的幅度一般在20%以下，因此，僅采取化學(xué)調(diào)控手段難于生產(chǎn)出滿足所推薦的煙堿限量標(biāo)準(zhǔn)的煙葉。

煙草莖部韌皮部環(huán)割可對(duì)地上部和地下部物質(zhì)運(yùn)輸形成物理阻隔。研究表明，在其他栽培措施一致的情況下，通過煙株莖基部距地面約5 cm 處韌皮部環(huán)切處理可以使煙葉中煙堿含量平均降低11.58%，特別對(duì)上部煙葉降低效果更加顯著，降幅可達(dá)到16.56%[57]。曾濤等（2005）[58]研究了煙草不同環(huán)割時(shí)期對(duì)煙堿含量的影響，結(jié)果表明最佳的環(huán)割時(shí)間是打頂當(dāng)天。羅海波等（2002）[59]的試驗(yàn)表明，環(huán)割使煙草葉片的硝酸還原酶活性下降，過氧化物酶的活性上升，根系活力降低，根系合成生物堿的能力下降，對(duì)降低上部葉片煙堿含量有積極的作用。

嫁接栽培技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于瓜果、蔬菜種植上，以提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高植物的生物及非生物脅迫抗性、促進(jìn)養(yǎng)分吸收，以及誘導(dǎo)遺傳變異等方面[60]。早在1942年Dawson采用煙草與同科的番茄等嫁接證明了煙草煙堿的合成部位位于根部，以煙草為接穗嫁接到茄子上的嫁接苗青枯病的抗性明顯提高[61]。本課題組于2017年以烤煙為接穗，同科的茄子為砧木，成功探索了煙茄種間嫁接技術(shù)，生產(chǎn)出超低煙堿含量煙葉，烤后煙葉煙堿含量降低至0.06%以下。此外，還可通過嫁接煙株培土，誘發(fā)接穗產(chǎn)生不定根生產(chǎn)出不同煙堿含量煙葉，為超低煙堿含量煙葉生產(chǎn)和對(duì)煙葉煙堿含量有效調(diào)節(jié)提供了新的途徑。

2.4 化學(xué)萃取

在煙葉的加工過程中，通常采用化學(xué)萃取來降低煙絲中煙堿的含量[62-63]。煙堿在煙葉或煙氣中均以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形態(tài)而存在。游離態(tài)的煙堿容易隨水蒸氣蒸餾揮發(fā)，通過在煙葉加工過程中的高溫和水蒸氣蒸餾作用，可以使其揮發(fā)脫除。而脫除結(jié)合態(tài)的煙堿，則需要提高煙葉的酸堿度（pH在4.5-9.5范圍內(nèi)），促使煙堿成為游離態(tài)，再采用加熱蒸餾等處理工藝就可以有效地脫除煙草原料中的煙堿化合物。而在煙堿脫除后，可以通過適當(dāng)?shù)奶砑铀嵝曰衔飦韺?duì)煙葉進(jìn)行pH值回調(diào)，以降低煙氣刺激，增加醇和度[64]。

利用超臨界流體物質(zhì)在超臨界狀態(tài)下對(duì)煙葉特定成分進(jìn)行萃取分離的技術(shù)（超臨界萃取法，Supercritical fluid extraction SFE），是近年來發(fā)展迅猛的一種高端提取分離技術(shù)[65-66]。SFE具有選擇性強(qiáng)、效率高、無有機(jī)溶劑殘留、操作條件溫和不破壞物料原有物理性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，已被煙草行業(yè)用于去除煙草中煙堿和煙草特有亞硝胺[67-68]。美國菲莫公司等利用超臨界萃取技術(shù)降低煙絲煙堿含量，推出了“NEXT”牌（“De Nicotine”）等一些低煙堿含量卷煙品牌，煙堿降低85%～97%[69-70]。

3 低煙堿煙葉質(zhì)量及化學(xué)成分變化

煙葉生物堿是煙株次生代謝產(chǎn)物，但與煙葉初生代謝密切相關(guān)，生物堿合成途徑的阻斷和抑制對(duì)煙株正常生理代謝會(huì)產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而影響煙葉農(nóng)藝性狀、經(jīng)濟(jì)性狀、化學(xué)成分和質(zhì)量呈現(xiàn)。然而，不同低煙堿煙葉生產(chǎn)技術(shù)所產(chǎn)生的影響顯著不同。

3.1 基于常規(guī)育種的低煙堿煙葉

3.1.1 煙葉農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的變化

基于雙基因隱性突變（nic1nic2）品系為材料的傳統(tǒng)育種方法培育的低煙堿品種與正常的高煙堿含量品種相比，煙株生育天數(shù)、葉數(shù)、葉片大小、株高無顯著差異，但煙葉經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)不佳[71]，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是煙株生長發(fā)育偏弱，營養(yǎng)體偏小，產(chǎn)量較低；二是煙葉成熟延遲，成熟期葉片色素降解慢，降解率低，采收時(shí)色素含量高，成熟度低；三是烤后含青率高，葉片平滑，品質(zhì)較差，根據(jù)USDA煙葉等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，煙葉等級(jí)結(jié)構(gòu)、價(jià)格及產(chǎn)值較低，由于品質(zhì)性狀不良，難于在卷煙配方中使用[72]；四是煙葉抗蟲性降低，易受昆蟲危害。鑒于低煙堿品種經(jīng)濟(jì)性狀和質(zhì)量性狀方面的缺陷，限制了其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。

3.1.2 煙葉化學(xué)成分含量的變化

基于自然突變和常規(guī)育種獲得的低煙堿品系除了煙堿和其它主要生物堿含量同步下降外，煙葉其它化學(xué)成分含量也發(fā)生一系列的變化。低煙堿品系LA B21蛋白質(zhì)氮顯著增高，但煙葉總氮含量、硝態(tài)氮含量、糖含量和總揮發(fā)性含氮堿類的含量明顯低于正常生物堿含量的品系[11,71,73]，不同部位葉片生物堿和含氮化合物的變化表現(xiàn)有相同的規(guī)律；低煙堿煙葉葉綠素、胡蘿卜素等色素含量顯著增加，脂類物質(zhì)則表現(xiàn)降低[74]。為解釋低煙堿品系色素含量增高和成熟不良的原因，Nolke等（2016）[75]分析了低煙堿品系和正常煙堿含量品系多胺類物質(zhì)含量的差異，包括游離態(tài)、可溶性結(jié)合態(tài)和非可溶性結(jié)合態(tài)多胺（腐胺、亞精胺、精胺等），結(jié)果表明，低煙堿品系煙株的根系和葉片中游離和結(jié)合態(tài)腐胺及精胺含量分別高于正常煙堿含量煙株根系和葉片中這些物質(zhì)的含量。低煙堿品系根葉中結(jié)合態(tài)多胺含量隨煙葉成熟而增加，且多胺含量與葉綠素和外觀表現(xiàn)呈正相關(guān)。通過施用多胺合成抑制劑DFMO可降低游離態(tài)多胺含量，并部分恢復(fù)煙葉的成熟特性，但不能降低結(jié)合態(tài)多胺水平和葉綠素含量，因此多胺和乙烯的平衡關(guān)系可能影響煙葉成熟衰老，但并不是唯一的影響因素，其機(jī)理有待揭示。

3.2 基于遺傳工程的低煙堿煙葉

3.2.1 煙株農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的變化

采用遺傳工程手段定點(diǎn)敲除或抑制煙堿合成關(guān)鍵基因的表達(dá)可以顯著降低煙堿含量，但對(duì)煙株生長發(fā)育和品質(zhì)性狀并無顯著不良影響。Chintapakorn等(2003)[31]以甲基腐胺轉(zhuǎn)移酶（PMT）為目標(biāo)基因，采用反義RNA技術(shù)下調(diào)PMT基因表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因品系PMT活性和煙堿含量都大幅下降，煙葉生長發(fā)育和農(nóng)藝性狀與正常煙堿含量品種表現(xiàn)相同，未出現(xiàn)不良影響，表明對(duì)煙堿合成途徑中單一基因進(jìn)行抑制并不會(huì)造成煙株生長發(fā)育性狀的改變。

Kudithipudi et al (2016)[72]報(bào)道了采用RNAi技術(shù)分別對(duì)生物堿合成關(guān)鍵基因腐胺甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)和煙堿合成途徑關(guān)鍵調(diào)控因子PR50進(jìn)行抑制，獲得了含有PMT和PR50的RNAi構(gòu)件的轉(zhuǎn)基因煙株。通過對(duì)該轉(zhuǎn)基因品系大田對(duì)比分析和對(duì)調(diào)制后煙葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)PMT-RNAi和PR50-RNAi轉(zhuǎn)基因品系煙葉煙堿含量分別比正常煙葉降低95%和80-90%，且煙葉等級(jí)與對(duì)照相同，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的低煙堿突變品系（nic1nic2）。用傳統(tǒng)的低煙堿突變系LA B21與轉(zhuǎn)基因品系PMT-RNAi和PR50-RNAi進(jìn)行RNA序列和代謝組分析比較發(fā)現(xiàn)，LA B21代謝物組成與兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系差異較大，其中PR50-RNAi與正常的高煙堿品系更為接近，這與其煙葉質(zhì)量等級(jí)結(jié)果相吻合，表明傳統(tǒng)的nic1nic缺失突變對(duì)相關(guān)代謝和代謝物組成影響較大，而基因定點(diǎn)改造對(duì)代謝物組成和質(zhì)量影響較小(Kudithipudi et al, 2017)[76]。他們進(jìn)一步采用基因編輯技術(shù)，對(duì)PMT和PR50基因進(jìn)行編輯，獲得了具有不同生物堿水平的PMT和PR50突變系。Cheek等（2016）[77]以K326為材料獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)基因低煙堿品系DH22A、DH32、DH16A與常規(guī)品種K326,NC95和LAFC-53進(jìn)行田間對(duì)比，發(fā)現(xiàn)煙堿含量比常規(guī)品種降低75-80%，這些轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)量和外觀質(zhì)量與K326相當(dāng)，且優(yōu)于NC95和LAFC-53。

傳統(tǒng)育種獲得的低煙堿品系煙葉農(nóng)藝和質(zhì)量性狀不良，可能由于這些低煙堿品系不僅生物堿合成有關(guān)基因受抑，其它連鎖基因也發(fā)生了相應(yīng)的變化。Sarah等(2006)[78]采用熒光差顯 (fluorescent differential display ，F(xiàn)DD) 技術(shù)進(jìn)行了正常高煙堿和低煙堿雙隱性突變煙株根部樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，表明A-B調(diào)控子包含一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的差異表達(dá)的脅迫響應(yīng)基因，在由A-B位點(diǎn)調(diào)控的33個(gè)基因家族中只有4個(gè)基因家族與生物堿合成有關(guān)，分別為A622, PMT,QPT, and QS，證實(shí)只有極少數(shù)基因參與調(diào)控?zé)焿A合成。Shoji等（2008）[36]報(bào)道nic2位點(diǎn)編碼一串乙烯響應(yīng)因子(ERF)基因。用ERF189基因擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)一些基因成員通過與煙堿合成基因啟動(dòng)子區(qū)域的GCC-box因子綁定而激活煙堿合成。Adams et al (2016)[79]通過比較白肋煙TN90及B21四個(gè)不同煙堿水平的近等系的基因序列發(fā)現(xiàn)了染色體上nic1位點(diǎn)所在的區(qū)域并對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行了研究。

3.2.2 煙葉化學(xué)成分的變化

通過遺傳工程手段獲得的低煙堿材料煙葉化學(xué)組成會(huì)產(chǎn)生一定的變化，但主要局限在生物堿組成和含量方面，且其差異表現(xiàn)依目標(biāo)基因的不同而不同。Chintapakorn et al (2003)[31]采用反義技術(shù)沉默煙堿合成的關(guān)鍵酶PMT，直接導(dǎo)致甲基吡咯環(huán)合成途徑受抑，煙堿含量顯著下降，但新煙草堿含量顯著增高，因此生物堿的組成比例發(fā)生改變。Northern雜交實(shí)驗(yàn)證明反義技術(shù)抑制PMT基因表達(dá)具有專一性，其對(duì)生物堿合成的其它基因表達(dá)水平?jīng)]有影響，包括煙酸合成途徑的關(guān)鍵酶QPT基因，因此新煙草堿合成增加可能是煙酸不能用于煙堿合成造成積累并更多地用于新煙草堿合成的直接結(jié)果。

以BBL基因作為目標(biāo)基因進(jìn)行抑制獲得的低煙堿轉(zhuǎn)基因煙草和誘變煙草不會(huì)造成其它吡啶類生物堿如新煙草堿和假木賊堿等的增加[40]，這是因?yàn)锽BL基因負(fù)責(zé)煙堿合成的最后環(huán)節(jié)，除煙堿外，其他一些吡啶類生物堿的合成可能均由BBL基因參與催化完成，BBL基因的抑制可同時(shí)影響所有吡啶類生物堿的合成。但這些作者報(bào)道了轉(zhuǎn)基因煙株根系中出現(xiàn)和積累了一種新的代謝產(chǎn)物dihydrometanicotine (DMN)，這是BBL基因受到抑制后用于生物堿合成的物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的。DMN只在根系中存在，在葉片中尚未發(fā)現(xiàn)，可能是煙株尚未啟動(dòng)或形成由根系向上轉(zhuǎn)運(yùn)該物質(zhì)的機(jī)制。

3.3 基于農(nóng)藝措施的低煙堿煙葉

通過施肥灌水、打頂留葉等栽培措施降低煙堿含量對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量有顯著的負(fù)面影響。減少氮肥施用，增加密度和單株留葉數(shù)，會(huì)造成葉片小，葉質(zhì)重低，單葉重小，葉色淡，油分少，香氣不足，產(chǎn)量和質(zhì)量顯著下降[80-81]。通過常規(guī)農(nóng)藝栽培措施降低烤煙煙堿含量會(huì)引起化學(xué)組成向不利于煙葉質(zhì)量提升的方向變化。氮肥減少或灌水過多或留葉過多，在煙堿含量降低的同時(shí)，其他生物堿含量、總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)含量下降，總糖、還原糖等碳水化合物含量上升，糖堿比、氮堿比、糖蛋比增加，類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、非酶棕色化產(chǎn)物、苯丙氨酸裂解產(chǎn)物等香氣物質(zhì)含量降低?？緹煙焿A含量與煙葉香味品質(zhì)和中性香氣物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)[82-83],煙堿含量降低導(dǎo)致煙葉生理強(qiáng)度和滿足感下降，香氣量減少。采用生長素類或乙烯等化學(xué)調(diào)控措施降低煙葉煙堿含量對(duì)其他化學(xué)成分含量影響相對(duì)較小，但有利于促進(jìn)煙葉化學(xué)成分之間的協(xié)調(diào)和增加煙葉鉀素含量[84-87]。

以茄子為砧木，烤煙云煙87為接穗產(chǎn)生嫁接煙草研究低煙堿煙葉農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分的變化。結(jié)果表明，煙茄嫁接條件下的煙株其株高、葉片數(shù)、葉面積、開花期等農(nóng)藝性狀與對(duì)照無顯著差異，煙葉外觀質(zhì)量也較為接近。但煙葉煙堿含量降至極低水平，鮮煙葉和烤后煙煙葉煙堿含量低至0.06%以下，比對(duì)照降低95%以上，假木賊堿含量也有所降低，但下降比例較小，可能與假木賊堿在葉片中有一定的合成能力有關(guān)[88]。在接穗底部培土誘發(fā)不定根產(chǎn)生，能夠促進(jìn)生物堿的合成，導(dǎo)致煙/茄培土的煙堿含量比煙/茄不培土升高；煙茄嫁接的煙葉葉綠素含量顯著高于對(duì)照，成熟相對(duì)較晚，但可正常成熟?？竞鬅熑~蛋白質(zhì)、淀粉、總氮含量較高，總糖含量降低。鮮煙葉和調(diào)制后煙葉氨基酸含量顯著高于正常煙堿含量煙葉，可能是氨基酸用于煙堿合成的數(shù)量減少而造成積累所致。

3.4 基于化學(xué)萃取的低煙堿煙葉

采用超臨界萃取等技術(shù)可以選擇性降低煙葉或煙絲煙堿含量，但其對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響依萃取程度和生產(chǎn)目的而不同。對(duì)于煙堿含量偏高的上部葉經(jīng)超臨界CO2萃取后，可使煙葉煙堿含量降低，化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)，而煙氣細(xì)膩性、柔順感提高，刺激性降低，雜氣減少，余味改善，且對(duì)煙香濃度無顯著影響[66]。喻世濤等（2009）[89]研究發(fā)現(xiàn)高煙堿與高焦油煙絲經(jīng)超臨界CO2處理后，其形狀、結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化，不僅煙絲中的煙堿與主要有害成分焦油、一氧化碳含量顯著減低，而且處理后的煙絲的生理感覺指標(biāo)符合煙草技術(shù)要求。

以去除煙絲中煙堿為目的進(jìn)行超臨界CO2處理生產(chǎn)超低煙堿含量煙葉，其感官質(zhì)量會(huì)受到顯著影響。由于煙堿對(duì)吸煙的感官體驗(yàn)至關(guān)重要，以無煙堿或超低煙堿煙絲生產(chǎn)的卷煙生理強(qiáng)度和滿足感顯著下降。Mckinney等（2014）[70]采用通過CO2超臨界萃取獲得的低煙堿煙葉與高煙堿含量煙葉按不同比例配合卷制不同煙堿含量試驗(yàn)卷煙，采用雙盲試驗(yàn)并基于吸煙者生物標(biāo)記含量變化，研究了120名成年吸煙者對(duì)煙堿含量不同、焦油相似的卷煙的感官反應(yīng)和吸煙行為變化，結(jié)果表明在吸用常規(guī)品牌Marlboro Gold的基礎(chǔ)上改吸低煙堿含量卷煙（0.28 mg/根和0.56 mg/根）和高煙堿含量卷煙（1.35 mg/根和1.68 mg/根）會(huì)導(dǎo)致感官反應(yīng)顯著改變，吸用低煙堿卷煙，體液中煙堿當(dāng)量、煙草特有亞硝胺代謝物(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol，NNAL）和血液中可鐵寧含量下降，但降煙堿的生物標(biāo)記物含量和每天吸煙支數(shù)增加，感官反應(yīng)表現(xiàn)為勁頭偏小并定性為“不喜歡”。因此，大幅度降低卷煙煙絲煙堿含量雖然可減少部分有害成分的攝入，但也會(huì)造成一定程度的補(bǔ)償抽煙而使一些有害成分?jǐn)z入增加，而且煙葉感官質(zhì)量會(huì)顯著下降，使消費(fèi)者接受程度降低。

4 展望

通過降低煙葉煙堿含量至使人致癮水平之下來減少人們對(duì)吸煙的依賴性這一理念雖然得到一些試驗(yàn)結(jié)果的支持，但煙葉作為卷煙生產(chǎn)的原料，大幅度降低其煙堿含量需考慮現(xiàn)實(shí)可行性、技術(shù)局限性和消費(fèi)者接受程度等。

目前來講，大規(guī)模種植和生產(chǎn)可滿足超低煙堿含量標(biāo)準(zhǔn)的煙葉尚不存在可行性。從現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)層面，雖然煙葉煙堿含量在不同品種、不同部位和不同栽培措施下生產(chǎn)的煙葉之間有較大的變異性，但距離0.4mg/g煙堿含量的標(biāo)準(zhǔn)要求還相差很大，且煙葉香味品質(zhì)顯著降低。通過遺傳工程手段從技術(shù)上可以大幅度降低煙葉煙堿含量生產(chǎn)超低煙堿含量煙葉，但在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用尚需時(shí)日，而且定向抑制和敲除煙堿合成的關(guān)鍵基因會(huì)造成煙葉化學(xué)組成、代謝產(chǎn)物，如生物堿組成和TSNA等發(fā)生改變，其對(duì)人體生理藥理方面的影響尚不清楚，而且關(guān)于轉(zhuǎn)基因或基因改造的煙葉在生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用還存在政策風(fēng)險(xiǎn)和限制，相關(guān)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題也會(huì)阻礙超低煙堿含量煙草的廣泛應(yīng)用。

更為重要的是，卷煙是供消費(fèi)者吸用的產(chǎn)品，消費(fèi)者對(duì)超低煙堿含量卷煙的感受和接受程度是可否實(shí)施大規(guī)模生產(chǎn)的重要依據(jù)。如果消費(fèi)者不能接受，超低煙堿煙葉和卷煙生產(chǎn)將舉步維艱，或者走進(jìn)死胡同。煙堿雖然對(duì)一些人來說具有致癮性，但其是煙葉中最重要的生理活性成分，它和煙葉的香味共同構(gòu)成了煙葉制品的核心要素和作為商品的特質(zhì)。大量研究證明，煙堿不屬于煙葉中的有害成分，在正常吸用條件下，煙堿不會(huì)產(chǎn)生毒性，反而可產(chǎn)生一些有益的生理、心理和藥理作用。煙堿可提神醒腦，提高記憶力，促進(jìn)思維活躍，增強(qiáng)方向感，消除孤獨(dú)感和恐懼感，還可預(yù)防一些老年疾病，很多人抽煙并不是因?yàn)橛邪a而發(fā)的被動(dòng)行為，而是出于職業(yè)、情緒、環(huán)境需要的主動(dòng)行為，如果煙制品中沒有煙堿，或者含量極低不能滿足消費(fèi)者的需要，卷煙也就失去了所具有的使用價(jià)值和存在價(jià)值。這不一定是管理者所希望看到的，因?yàn)榭赡芤驗(yàn)椴荒軓暮戏ㄇ阔@得所需產(chǎn)品因此而產(chǎn)生新的社會(huì)問題。因此，對(duì)卷煙煙堿含量的管控必須十分慎重，需要對(duì)其可行性、現(xiàn)實(shí)性和可能產(chǎn)生的后果進(jìn)行充分的研究和論證。