陳蘭煊 任 思 易翠平

(長沙理工大學化學與生物工程學院健康谷物制品研究所，長沙 410114)

淀粉結(jié)合蛋白(starch granule-associated proteins，SGAPs)是和植物淀粉粒表面或內(nèi)部緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.2%～0.5%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，SGAPs參與谷物淀粉的合成與代謝，其含量及表達決定了淀粉顆粒中直鏈淀粉與支鏈淀粉的分布[2]，由此影響谷物的加工品質(zhì)。但近年來，關(guān)于SGAPs的研究主要集中在蠟質(zhì)基因在不同植物組織中的表達、電泳等方法分離不同品種或籽粒的同工酶等方面[3-6]，而對于SGAPs與淀粉的相互作用和對淀粉的基本性質(zhì)的影響鮮有報道。

1 SGAPs的概述

1986年，淀粉結(jié)合蛋白(starch granule-associated proteins，SGAPs)這一概念第一次被正式提出[1]，指天然位于淀粉粒表面或內(nèi)部的一類蛋白，它們不同于儲藏蛋白(谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白及球蛋白)和細胞內(nèi)蛋白[7]。目前為止，不同來源的植物淀粉中發(fā)現(xiàn)了多種SGAPs，它們均含有大量的疏水性氨基酸，部分SGAPs是淀粉生物合成或降解后 “留下”的酶，因此形成了顆粒內(nèi)外將其緊密包裹的結(jié)構(gòu)。由于SGAPs與淀粉顆粒結(jié)合緊密，含量較少，分離也較困難，因此常采用十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DDT)等強極性溶劑對其進行提取，并以SDS-PAGE凝膠電泳分析不同種類SGAPs的分布情況[8]。根據(jù)相對分子質(zhì)量大小，這些SGAPs被分成兩大類[9-10]：結(jié)合在淀粉顆粒表面的低相對分子質(zhì)量SGAPs(Ms 5、8、15、19、30 ku)；存在于淀粉顆粒的內(nèi)部的高相對分子質(zhì)量SGAPs(Ms 60、77、86、95、149 ku)。

一般大米淀粉中可分離出3種較為典型的SGAPs：60 ku左右的淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)又稱蠟質(zhì)蛋白(waxy protein)，這種蛋白分為2種亞型GBSSⅠ和GBSSⅡ；30 ku的蛋白以及15 ku的一組復合肽段被統(tǒng)稱為friabilin蛋白，其中puroindoline A (PINA)和puroindoline B (PINB)兩種多肽表現(xiàn)較為突出[2, 11]。

2 SGAPs的分離純化

2.1 低相對分子質(zhì)量SGAPs的分離

SGAPs與淀粉顆粒間以多種復雜化學鍵緊密連接，研究表明，采用NaCl溶液、2-丙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)和二硫蘇糖醇(DTT)等強極性溶液對淀粉顆粒進行攪拌浸泡可分離出一部分SGAP。如用鹽溶液0.1 mol/L的NaCl;0.05 mol/L的NaCl;1%～2%SDS(含有1%β-巰基乙醇)；10 mmol/L DDT,SDS-PAGE緩沖溶液或甲苯在室溫條件下均可將低相對分子質(zhì)量的SGAPs(5～30kDa)從淀粉粒中提取出[12]。然而這些溶液不能提取出全部淀粉粒表面SGAP，Lowy等[13]報道NaCl溶液提取物只有總SGAP的10%。Turnbull等[14]證明1%～2% SDS不能得到最多的SGAPs，采用10% SDS溶液進行提取可獲得更多的SGAPs。

2.2 高相對分子質(zhì)量SGAPs的分離

對于相對分子質(zhì)量較高的內(nèi)部SGAPs，無論采用高鹽濃度還是低鹽濃度緩沖液都無法將其分離出來。這部分蛋白被包埋在淀粉顆粒的內(nèi)部，在普通條件下反應試劑無法與顆粒內(nèi)部SGAPs作用，但可在≥50℃時用含有還原劑的1%～2% SDS溶液萃取膨脹糊化淀粉粒提取淀粉粒內(nèi)部高相對分子質(zhì)量SGAPs(59～149 kDa)。據(jù)Bancel等[12]報道，淀粉顆粒部分膨脹糊化后，分子的有序結(jié)構(gòu)被打破，結(jié)合在淀粉顆粒內(nèi)部的SGAPs暴露在溶液中與SDS或DTT等緩沖液進行反應解離出內(nèi)部SGAPs?？梢园l(fā)現(xiàn)在對于SGAPs的分離過程中不同的提取溶劑濃度以及不同的提取條件會對提取的SGAPs的含量和質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，張軍杰等[15]證明，采用SDS溶液對玉米籽粒中的SGAPs進行提取時，10% SDS緩沖液為最佳提取濃度，在此濃度下SGAPs達到358.723 μg/g，對于在煮沸提取時，當煮沸時間達到5 min時所提取的SGAPs蛋白量最高。此外，郭華等[16]研究表明，在SGAPs提取過程中Mg2+對GBSS的解離有顯著影響，初步證實GBSS與淀粉粒主要是通過非共價鍵結(jié)合。這一研究結(jié)果進一步證明了有部分SGAPs是通過化學鍵與淀粉粒結(jié)合，因此SGAPs與淀粉的結(jié)合力可能受到不同離子的影響，隨離子類型與強度的變化而變化。閆榮[17]采用不同緩沖液對淀粉分子處理發(fā)現(xiàn)，硫脲、SDS、L-半脫氨酸試劑以及改變?nèi)芤后w系pH對淀粉中SGAPs的提取的率有顯著影響，說明淀粉顆粒與SGAPs之間主要依靠疏水作用、氫鍵和靜電引力結(jié)合，其中表面SGAPs主要通過疏水作用力、靜電引力與淀粉結(jié)合，而內(nèi)部SGAPs則主要通過氫鍵。由此可見，SGAPs與淀粉分子之間的復合不是由單一作用完成,而是以多種分子間作用力包括共價鍵、氫鍵、離子鍵、二硫鍵等作用力及分子纏繞等作用的綜合結(jié)果。

2.3 大米中SGAPs的分離

有學者將大米蛋白分為可提取蛋白(含醇溶蛋白、谷蛋白等貯藏蛋白及具有酶活性的清、球蛋白)和不可提取蛋白(淀粉結(jié)合蛋白)[17]。易翠平等[18]曾報道，以堿法制備大米淀粉可分離出高純度的大米淀粉及大米蛋白，在分離大米淀粉的過程中得到三層形態(tài)不一的淀粉，分別是最上層的淀粉糊精，中層白淀粉(即高純度精制淀粉)，下層黃淀粉。但值得關(guān)注的是堿法所提的高純度大米淀粉中依然含有0.39%的蛋白質(zhì)，結(jié)合以往SGAPs質(zhì)量分數(shù)在0.2%～0.5%之間的報道，有理由推測此部分蛋白主要是緊密嵌入在淀粉粒表面及內(nèi)部的SGAPs。在Adebiyi等[19]的米糠蛋白分級實驗當中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過逐級提取后的米糠淀粉顆粒中仍有0.2%的蛋白存在。因此，考慮采用去蛋白淀粉或精制白淀粉為原料對SGAPs進行分離可能是更為簡便的方法。Han等[20]也發(fā)現(xiàn)堿提大米淀粉中保留了一部分SGAPs，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)在大米淀粉在堿性提取過程中有部分喪失，通過對比經(jīng)過不同分離階段淀粉的糊化特性變化發(fā)現(xiàn)，SGAPs對淀粉糊化特性有顯著影響。

3 不同分子質(zhì)量的SGAPs對淀粉基本品質(zhì)的影響

淀粉分子在稻米中以顆粒的形式存在。盡管SGAPs的形成過程非常復雜，含量較少，分離也較困難，但它的存在對于淀粉的合成、品質(zhì)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等具有重要的作用[21]。結(jié)合在淀粉顆粒內(nèi)部的SGAPs常常表現(xiàn)為各種與淀粉相關(guān)的合成酶，與直鏈淀粉緊密結(jié)合在一起影響秈米的基本性質(zhì)：降低糊的黏度，通過增加淀粉凝膠的硬度而降低由剪切引起的淀粉破損等。在目前這些已知的SGAPs里，Han等[20]證明SGAPs對淀粉糊化特性顯著影響；Fujita等[22]證明GBSS I與淀粉的合成緊密相關(guān)，可以延長直鏈淀粉和支鏈淀粉的外鏈長度；friabilin蛋白對籽粒質(zhì)地及硬度有明顯影響。

3.1 非酶類SGAPs對淀粉基本品質(zhì)的影響

3.1.1 Friabilin/puroindoline蛋白

相對分子質(zhì)量為15 ku的低相對分子質(zhì)量SGAPs被認為是在谷物顆粒生長過程中影響胚乳硬度的首要因素。1988年，Spencer[23]從軟質(zhì)小麥中提取出并用SDS-PAGE電泳分析證明15 ku的蛋白與小麥籽粒的硬度極顯著相關(guān)，首次將其命名為friabilin蛋白。隨著分離和檢測方法的發(fā)展，根據(jù)多個N-末端氨基酸殘基的檢測發(fā)現(xiàn) 15 ku的蛋白是由幾組質(zhì)量相近的多肽構(gòu)成，其主要組成成分為puroindoline-a 和-b，遺傳分析表明 PINA 和PINB 基因位于染色體Ha(hardness)位點的5D染色體上[7]，這是一類富含半胱氨酸的親脂膜蛋白。Friabilin與谷物胚乳品質(zhì)密切相關(guān)，影響其制粉和用途。Morrison等[24]采用英國小麥研究表明非極性脂的含量與籽粒硬度有高度相關(guān)，非極性脂類含量越高則胚乳硬度越低，而puroindoline基因能影響淀粉顆粒中非極性脂類的合成[25]。PINA和PINB的特性還對胚乳內(nèi)蛋白質(zhì)與淀粉顆粒的結(jié)合一定有影響，直徑較小的B-級淀粉顆粒較大的A-級淀粉的friabilin/puroindoline蛋白含量更高，且呈不連續(xù)形態(tài)附著于顆粒表面[26-27]。常成等[28]在研究puroindolines蛋白在小麥籽粒的發(fā)育時期與硬度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在軟質(zhì)和硬質(zhì)小麥籽粒不同發(fā)育時期，其表達是有差異的——軟質(zhì)小麥籽粒淀粉粒表面結(jié)合 puroindolines蛋白量顯著高于硬質(zhì)小麥。郭世華等[29]研究發(fā)現(xiàn)friabilin蛋白表達量與籽粒硬度呈顯著負相關(guān)，friabilin譜帶強，籽粒硬度數(shù)值低，與軟麥和硬麥的SKCS測定值之間的關(guān)系數(shù)為-0.68和-0.66，達到了1%的顯著水平。因此puroindoline蛋白的含量、結(jié)構(gòu)、基因型等均與谷物胚乳的硬度有著十分密切聯(lián)系。大米淀粉中也被證實30 ku的friabilin蛋白的存在，但friabilin蛋白對大米籽粒的硬度是否有影響尚鮮見研究報道。

3.1.2 30 ku肽段

不同于friabilin/puroindoline蛋白，對于30 ku的肽段研究鮮有報道。Lowy等[13]和Debet等[30]采用0.1 mol/L NaCl將位于淀粉顆粒表面的這部分蛋白分離出來，且DTT等還原劑與這部分蛋白提取率非顯著性相關(guān)，證明這部分蛋白并非以二硫鍵與淀粉顆粒結(jié)合。同時Lowy等[13]發(fā)現(xiàn)該蛋白在發(fā)芽的谷物中不存在，表明這部分蛋白是發(fā)芽稻米用于代謝的蛋白。韓永斌等[31]通過對比發(fā)芽前后的糙米的糊化特性發(fā)現(xiàn)，糙米發(fā)芽后，30 ku肽段消失，與含有30 ku肽段的未發(fā)芽糙米比較，淀粉糊黏度降低。

3.2 生物酶類SGAPs對淀粉基本品質(zhì)的影響

60 ku的GBSS是合成直鏈淀粉的關(guān)鍵酶，也是與淀粉顆粒結(jié)合的大米發(fā)育過程中唯一有酶活力的蛋白。GBSS有兩種同工酶，即GBSS I和GBSSⅡ，前者主要存在于籽粒儲藏器官中控制合成線性葡聚糖，后者主要存在于非貯藏組織，如葉、綠莖等合成直鏈淀粉[1]。編碼GBSS的基因位于染色體的‘糯’位點上，因此被稱為Waxy基因。當Waxy基因的缺失或突變時，胚乳中直鏈淀粉合成減少，支鏈淀粉含量上升。糯性水稻也是由于Waxy基因的突變導致無法正常合成直鏈淀粉，直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)一般在2%左右。Pandey等[32]報道GBSSI在淀粉合成過程中作用于支鏈淀粉外側(cè)的葡萄糖鏈使之延長，使淀粉中的某些非結(jié)晶性區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶區(qū)域。雖然目前鮮有關(guān)于GBSS含量或結(jié)構(gòu)等與淀粉糊化特性的相關(guān)性的系統(tǒng)研究，但卻可以發(fā)現(xiàn)GBSS在淀粉合成過程中通過決定淀粉顆粒的基本特性而影響大米淀粉的糊化特性，如GBSS決定了淀粉顆粒中直支比及聚合度。研究發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量與淀粉糊化特性呈顯著正相關(guān)；GBSS對淀粉結(jié)晶區(qū)域和支鏈淀粉的晶型結(jié)構(gòu)均有很大影響[33]，而大米淀粉的糊化溫度隨著結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)比例的減小而降低[34]。因此，GBSS作為生物酶緊密結(jié)合于淀粉顆粒內(nèi)部，對淀粉的糊化特性有著很大影響。

據(jù)李艷等[35]報道，黃淀粉中的蛋白主要為蛋白體與纖維素的結(jié)合體，而白淀粉中所含的相對分子質(zhì)量為60 ku的亞基可能對大米淀粉的糊化性質(zhì)起著非常重要的作用。60 ku的GBSS是大米SGAPs的主要成分，它與淀粉的相互結(jié)合共同決定大米粉的基本糊化特性。

4 結(jié)語及展望

大米中SGAPs作為一種重要組分存在于淀粉顆粒之中，控制著淀粉顆粒的合成、結(jié)構(gòu)及淀粉基本特性，并與其他組分共同作用，影響淀粉粒的基本性質(zhì)乃至整個谷物體系的品質(zhì)和應用。雖然早期的研究更多關(guān)注谷物中的儲藏蛋白，但由于SGAPs與淀粉性質(zhì)的密切相關(guān)性，近年來亦逐漸受到關(guān)注?，F(xiàn)有研究雖表明SGAPs確實對淀粉品質(zhì)有很大影響，但SGAPs的具體結(jié)合狀態(tài)及其作用機制尚不明確，未來研究可考慮從SGAPs與淀粉顆粒結(jié)合構(gòu)型及其生物代謝方式入手，明確SGAPs對淀粉顆粒的具體影響機制。

[1]KOZIOL A G, MARQUEZ B K, HUEBSCH M P, et al. The starch granule associated proteomes of commercially purified starch reference materials from rice and maize[J]. Journal of Proteomics , 2011, 75(3):993-1003

[2]YU H, TAI W. Proteomic dissection of endosperm starch granule associated proteins reveals a network coordinating starch biosynthesis and amino acid metabolism and glycolysis in rice endosperms[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 1(7):707-716

[3]YAMANAKA S, NAKAMURA I, WATANABE K N, et al. Identification of SNPs in the waxy gene among glutinous rice cultivars and their evolutionary significance during the domestication process of rice[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108(7):1200-1204

[4]CHEN M H, BERGMAN C, PINSON S, et al. Waxy gene haplotypes: Associations with apparent amylose content and the effect by the environment in an international rice germplasm collection [J]. Journal of Cereal Science, 2008, 47(3):536-545

[5]GOLDNER W R, BOYER C D. Starch granule-bound proteins and polypeptides: the influence of the waxy mutations[J]. Starch-St?rke, 2006, 41(7):250-254

[6]ASARE E K, B?GA M, ROSSNAGEL B G, et al. Polymorphism in the barley granule bound starch synthase 1 (Gbss1) gene associated with grain starch variant amylose concentration[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2012, 60(40):10082

[7]BALDWIN P M. Starch granule-associated proteins and polypeptides: A review[J]. Starch-St?rke, 2015, 53(53):475-503

[8]YOON J W, JUNG J Y, CHUNG H J, et al. Identification of botanical origin of starches by SDS-PAGE analysis of starch granule-associated proteins[J]. Journal of Cereal Science, 2010, 52(2):321-326

[9]MOTOKO T, SHOGO W, HIDENORI S, et al. Structural characterization of high molecular weight starch granule-bound proteins in wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1997, 45(45):2929-2934

[10]MACDONALD F D, PREISS J. Partial purification and characterization of granule-bound starch synthases from normal and waxy maize[J]. Plant Physiology, 1985, 78(4):849-852

[11]HAMAKER B R, GRIFFIN V K, KAK M. Potential influence of a starch granule-associated protein on cooked rice stickiness[J]. Journal of Food Science, 2010, 56(5):1327-1329

[12]BANCEL E, ROGNIAUX H, DEBITON C, et al. Extraction and proteome analysis of starch granule-associated proteins in mature wheat kernel (Triticum aestivum L.)[J]. Journal of Proteome Research, 2010, 9(6):3299-3310

[13]LOWY G D A, SARGEANT J G, SCHOFIELD J D. Wheat starch granule protein the isolation and characterization of a salt extractable protein from starch granules[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture ,1981 , 32 (4):371-377

[14]Turnbull K M, Rahman S. Endosperm Texture in Wheat[J]. Journal of Cereal Science, 2002, 36(3):327-337

[15]張軍杰, 胡育峰, 黃玉碧. 玉米籽粒淀粉結(jié)合蛋白分離純化研究[J]. 中國農(nóng)學通報, 2007, 23(10):234-237 ZHANG J J, HU Y F, HUANG Y B. Extract starch-granule associated proteins in starch granules from maize endosperm[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2007, 23(10):234-237

[16]郭華，王憲澤, 李海雷，等. 中國春小麥GBSS與淀粉顆粒結(jié)合特性的研究[J]. 作物學報, 2007, 33(2):322-326 GUO H, WANG X Z, LI H L, et al. Binding characteristics of granule-bound starch synthase (GBSS) with starch in wheat cultivar Chinese spring[J]. Acta Agronomica Sinica, 2007, 33(2):322-326

[17]閆榮. 玉米淀粉與蛋白質(zhì)組合結(jié)構(gòu)及分離機理研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學, 2016 YAN R.Rearch of the combined structure and separation mechanism of starch and protein in corn[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2016

[18]易翠平, 姚惠源. 高純度大米蛋白和淀粉的分離提取[J]. 食品與機械, 2004, 20(6):18-21 YI C P, YAO H Y.Isolation of rice protein and rice starch[J]. Food & Machinery, 2004, 20(6):18-21

[19]ADEBIYI A P, ADEBIYI A O, HASEGAWA Y, et al. Isolation and characterization of protein fractions from deoiled rice bran[J]. European Food Research and Technology, 2009, 228(3):391-401

[20]HAN X Z, HAMAKER B R. Partial leaching of granule-associated proteins from rice starch during alkaline extraction and subsequent gelatinization[J]. Starch-St?rke, 2002, 54(10):454-460

[21]MESTRES C, RIBEYRE F, PONS B, et al. Sensory texture of cooked rice is rather linked to chemical than to physical characteristics of raw grain[J]. Journal of Cereal Science, 2011, 53(1):81-89

[22]FUJITA N, HANASHIRO I, SUZUKI S, et al. Elongated phytoglycogen chain length in transgenic rice endosperm expressing active starch synthase IIa affects the altered solubility and crystallinity of the storage α-glucan[J]. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(16):5859-5872

[23]SPENCER B. Soft wheat-view from great-britain[J]. Cereal Foods World,1988, 33(8):666

[24]MORRISON W R, GREENWELL P, LAW C N, et al. Occurrence of friabilin, a low molecular weight protein associated with grain softness, on starch granules isolated from some wheats and related species[J]. Journal of Cereal Science, 1992, 15(2):143-149

[25]ALFRED R L, PALOMBO E A, PANOZZO J F, et al. The co-operative interaction of puroindolines in wheat grain texture may involve the hydrophobic domain[J]. Journal of Cereal Science, 2014, 60(2):323-330

[26]吳桂玲. 脂類和顆粒結(jié)合蛋白對小麥A、B淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及理化性能的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2015 WU G L.Effects of lipids and granule associated proteins on physiochemical properties of a, b wheat starches[D]. Yangling:Northwest A & F University, 2015

[27]GEERA B P, NELSON J E, SOUZA E, et al. Composition and properties of A-and B-type starch granules of wild-type, partial waxy, and waxy soft wheat[J]. Cereal Chemistry, 2006, 83(5):551-557

[28]常成, 張海萍, 李保云，等. 小麥籽粒發(fā)育時期Puroindolines蛋白與硬度的關(guān)系[J]. 麥類作物學報, 2007, 27(4):630-633 CHANG C, ZHANG H P, LI B Y, et al. The relationship between puroindolines protein during grain development and kernel hardness of common wheat[J]. Journal of Triticeae Crops, 2007, 27(4):630-633

[29]郭世華, 何中虎, 王洪剛，等. Friabilin蛋白表達量與小麥籽粒硬度的關(guān)系[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2003, 36(9):991-995 GUO S H, HE Z H, WANG H G, et al.Association Between Friabilin Protein and Grain Hardness in Common Wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2003, 36(9):991-995[30]DEBET M R, GIDLEY M J. Three classes of starch granule swelling: Influence of surface proteins and lipids[J]. Carbohydrate Polymers, 2006, 64(3):452-465

[31]韓永斌, 李冰冰, 劉桂玲，等. 發(fā)芽糙米淀粉糊化特性變化研究[J]. 中國糧油學報, 2008, 23(6):1-4 HAN Y B, LI B B, LIU G L, et al.Gelatinization Properties of Brown Rice and Germinated Brown Rice[J]. Journal of The Chinese Cereals and Oils Association, 2008, 23(6):1-4

[32]PANDEY M K, RANI N S, MADHAV M S, et al. Different isoforms of starch-synthesizing enzymes controlling amylose and amylopectin content in rice (Oryza sativa L.)[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6):1697-1706

[33]HAMAKER B R, GRIFFIN V K. Effect of disulfide bond-containing protein on rice starch gelatinization and pasting[J]. Cereal Chemistry, 1993, 70(4):377-380

[34]PARADA J, AGUILERA J M. Effect of native crystalline structure of isolated potato starch on gelatinization behavior and consequently on glycemic response[J].Food Research International, 2012, 45(1):238-243

[35]李艷, 高文明, 易翠平. 堿提殘余蛋白對秈米糊化特性的影響[J]. 食品與機械, 2016, (4):5-8 LI Y, GAO W M, YI C P.Residual protein treated by alkali on the pasting properties of indica rice[J]. Food & Machinery, 2016, (4):5-8.