陳會娟，劉明典，汪登強，董微微2,，呂 浩，陳大慶，李 云

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)作為“四大家魚”之一，分布于全國各大江河及附屬水體，長江是我國鰱天然種質(zhì)資源的重要產(chǎn)地[1]。由于鰱在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖和水生態(tài)環(huán)境修復(fù)中具有重要的地位，其遺傳多樣性一直是人們關(guān)心的主要問題。近年來監(jiān)測表明，鰱的資源量正處于衰退之中，長江中上游部分江段鰱在漁獲物中已不成優(yōu)勢種[2]，并且仔魚數(shù)量呈下降趨勢[3]。為了在補充長江鰱資源的同時進行生態(tài)修復(fù)，近年來中國在長江各省均開展了增殖放流活動[4]，增殖放流活動在修復(fù)漁業(yè)資源的同時，也會給增殖水域野生群體的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)以及生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能帶來諸多風(fēng)險[5-6]。另外，鰱為江湖洄游型魚類，葛洲壩和三峽大壩的建設(shè)阻斷了長江上游和中游鰱群體的交流，可能會導(dǎo)致其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的變化。近期一些研究表明，河流大壩建設(shè)對魚類特別是洄游型魚類的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)造成了一定的影響[7-8]。

從上世紀80年代以來，不同學(xué)者采用不同的分子標記開展了鰱群體遺傳學(xué)研究[9-10]，取得了不少成果。研究結(jié)果表明，我國三條主要河流鰱群體間并沒有明顯的遺傳分化，但與國外引入群體已經(jīng)有顯著遺傳分化[11]。目前的研究較少涉及長江上游群體，僅見王長忠等[12]和龐美霞等[13]采用微衛(wèi)星標記對長江上游群體進行了研究。長江中游和上游均存在鰱重要的自然產(chǎn)卵場，是維持長江中游種質(zhì)資源的最重要場所。當(dāng)前，長江鰱群體受到過度捕撈、大壩阻隔、水體污染、大規(guī)模增殖放流等人類活動的影響不斷加劇，研究長江中上游鰱群體當(dāng)前的遺傳背景，比較上、中游群體遺傳結(jié)構(gòu)以及近年來遺傳多樣性的變化，對長江鰱群體的資源保護和科學(xué)管理具有重要意義。本研究采用線粒體Cytb基因以及D-loop序列對長江中上游4個鰱群體開展研究，比較上中游群體的遺傳分化及近年來長江群體遺傳多樣性變化情況，以評估人類活動對鰱種質(zhì)資源的影響，并為制定種質(zhì)資源保護措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及基因組DNA提取

本實驗4個鰱群體共151尾樣本采于2016年6-9月漁業(yè)資源調(diào)查期間，樣本均為漁民捕獲的長江魚苗，其中長江上游重慶江津江段(JJ)42尾、長江中游湖北宜昌江段(YC)30尾、嘉魚江段(JY)34尾和黃岡江段(HG)45尾(圖1)。每尾樣本剪取少量鰭條，用無水乙醇保存，帶回實驗室。

基因組DNA提取方法采用酚-氯仿法[14]。

圖1 長江中上游4個鰱野生群體的地理分布Fig.1 Location map of 4 populations of H.molitrix from middle and upper Yangtze River

1.2 PCR擴增及測序

分別擴增樣本的線粒體DNA Cytb基因和控制區(qū)(D-loop)序列。

引物序列[15]：Cytb:L14724:5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，H15915:5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′；D-loop[16]:MitDI-F:5-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′，MitDI-R:5′ -GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3′。

PCR 的 反 應(yīng) 總 體 積 為 50 μL，其 中 包括 10×Buffer(Mg2+)5 μL、模板 45～60 ng、Taq 酶(5 U/L)0.4 μL、dNTPs(10 mmol/L)0.6 μL、10 μmol/mL上下引物各 2 μL，最后用滅菌雙蒸餾水補至 50 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 6 min。PCR 產(chǎn)物檢測選用1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后送往測序公司雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定的 DNA 序列經(jīng)手工校對后，用ClustalX[17]對序列進行對位排列。利用MEGA 6.0[18]分析軟件計算群體間遺傳距離、統(tǒng)計序列的平均堿基組成、計算轉(zhuǎn)換/顛換比率。DnaSP 5.0軟件[19]被用來統(tǒng)計單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)及種群間基因流情況(Nm)；以單倍型為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖用Network 4.6.1.0軟件構(gòu)建。以Arlequin 3.11 軟件中的方差分析(AMOVA)[20]方法估算遺傳變異固定指數(shù)(FST)值，設(shè)置1 000次重復(fù)隨機抽樣重排后進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異分析

151個樣本共擴增出135條Cytb序列，經(jīng)比對后序列長968 bp。分析顯示，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)，Ts/Tv=10.39。A、T、C、G平均堿基組成為29.12%，29.28%，27.60%和14.00%，T+A含量(58.4%)高于G+C(41.6%)，表現(xiàn)出明顯的反G偏倚，顯示魚類Cytb基因的共同特征。共發(fā)現(xiàn)53個(5.5%)變異位點，包括44個(4.5%)簡約信息位點和9個(0.9%)單變異位點。135個個體中，共定義了19個單倍型。

151個樣本共擴增出150條D-loop序列，序列長890 bp，Ts/Tv=8.25。A、T、C、G平均堿基組成為33.65%，32.50%，20.11%和13.74%，同Cytb一樣，表現(xiàn)出明顯的反G偏倚。共發(fā)現(xiàn)94個(10.6%)變異位點，包括83個(9.3%)簡約信息位點和11個(1.2%)單變異位點。150個個體中，共定義了48個單倍型。

2.2 群體遺傳多樣性分析

如表1 所示，Cytb序列中各群體的單倍型多樣性介于0.416～0.810之間，核苷酸多樣性介于0.001 71～0.015 30之間，其中江津(JJ)群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均最高；D-loop序列中各群體的單倍型多樣性介于0.874～0.918之間，核苷酸多樣性介于0.007 17～0.029 23之間，同Cytb分析結(jié)果一樣，江津(JJ)群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均最高。

表1 鰱群體內(nèi)遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity parameters within populations of H.molitrix

注：GN-群體名字；S-多態(tài)性位點數(shù)；Hd-單倍型多樣性；Pi-核苷酸多樣性；HN-單倍型數(shù)

2.3 群體間的遺傳分化

4個群體分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，2種標記的遺傳分化指數(shù)(FST)均達到了極顯著水平(FST=0.186 36**，Cytb標記；FST=0.083 94**，D-loop標記)，表明4個群體間出現(xiàn)了遺傳分化。對4個群體進行兩兩分析，F(xiàn)ST和基因流如表2所示，不管是Cytb序列或是D-loop序列，就FST來說，JJ群體與中游3個群體均出現(xiàn)了顯著的遺傳分化，中游3個群體之間無分化；就基因流來說，江津群體與另外3個群體之間并不是隨機交配的，存在遺傳分化現(xiàn)象(Nm絕對值小于4)，中游3個群體之間基因交流頻繁，無遺傳分化現(xiàn)象(Nm絕對值均明顯大于4)。

表2 鰱4個群體間的遺傳分化指數(shù)(對角線上) 和基因流(對角線下) Tab.2 Pairwise gene flow(below diagonal)and genetic differentiation index Fst(above diagonal) among 4 populations of H.molitrix

注：*說明遺傳分化顯著(P<0.05)；**說明遺傳分化極顯著(P<0.01)

2.4 群體的單倍型進化關(guān)系

Cytb序列定義的19個單倍型如圖2 A。其中H_1分布于4個群體，且分布最為廣泛，頻率最高，可能是原始單倍型。19個單倍型中，共享單倍型有7個，比例較低(36.8%)，其中有3個為4個群體所共有。

D-loop序列定義的48個單倍型如圖2 B。單倍型分布比較分散，沒有明顯的中心，其中Hap_2分布于4個群體，且分布最為廣泛，可能是原始單倍型。除了Hap_2頻率較高以外(20.5%)，其他單倍型頻率均較低，有18個單倍型為2個及2個以上群體所共有，僅有2個單倍型是4個群體共有。

圖2 鰱單倍型中值連接網(wǎng)絡(luò)分析圖(A:Cyt b；B:D-loop)Fig.2 The haplotype network of H.molitrix(A:Cyt b；B:D-loop) 每個單倍型按地理分布不同用不同的顏色表示；圓圈大小表示該單倍型出現(xiàn)的次數(shù)。

基于Kimura 2-parameter 模型用單倍型數(shù)據(jù)構(gòu)建N-J(Neighbour-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，Cytb序列單倍型構(gòu)建的N-J樹明顯分為2個譜系，H_9單獨為一個譜系，其他單倍型分為一個譜系，2個譜系間平均K2P遺傳距離為0.039 03，分化水平極顯著(FST=0.935 61，P<0.01)。2個譜系內(nèi)的平均核苷酸變異數(shù)(k)分別為2.583和0.000，2個譜系間為7.245；D-loop序列單倍型構(gòu)建的N-J樹也明顯分為2個譜系，Hap_24/25/35/48為一個譜系，其他單倍型為一個譜系。2個譜系間平均K2P遺傳距離為0.076 24，分化水平極顯著(FST=0.885 77，P<0.01)。2個譜系內(nèi)的平均核苷酸變異數(shù)(k)分別為7.226和2.133，2個譜系間為58.550。

圖3 鰱基于單倍型構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(A:Cyt b序列；B:D-loop序列)Fig.3 The N-J phylogenetic trees based on haplotype(A:Cyt b；B:D-loop)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，長江中上游4個鰱群體遺傳多樣性高于贛江群體(D-loop：Hd=0.727，Pi=0.008 97，935 bp)而低于瑞昌群體(D-loop：Hd=0.978，Pi=0.011 35，935 bp)的研究結(jié)果[21]，也低于日本利根川盆地的引進鰱群體(D-loop：Hd=0.920，Pi=0.011)[22]，總體上處于中等水平。無論是Cytb還是D-loop序列都顯示，江津群體遺傳多樣性都高于中游的群體，這與王長忠等[12]采用微衛(wèi)星標記的研究結(jié)果是一致的，證實了長江上游鰱的群體遺傳多樣性高于中游群體。由于缺乏葛洲壩及三峽工程截流前的數(shù)據(jù)，長江上中游鰱群體的這種差異是種群歷史演化形成的，還是人類活動造成的，還有待進一步研究。同時，分析發(fā)現(xiàn)，宜昌群體的遺傳多樣性是最低的，特別是Cytb遺傳多樣性水平明顯低于其他群體(表1)，由于采樣是在一個時間段從不同漁民漁獲物中隨機采集，可以排除采樣誤差，考慮到2016年長江中游雨量較往年大，造成沿江養(yǎng)殖場養(yǎng)殖魚類大量逃逸，而宜昌附近的清江高壩洲、隔河巖等水庫泄洪，引起大量魚類進入長江，這是否會降低該江段鰱遺傳多樣性水平，需進一步分析。

從遺傳分化指數(shù)來看，江津群體與其余群體間遺傳分化均達顯著水平(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)，而長江中游3個群體間遺傳FST均低于5%(表2)，說明上游與中游群體發(fā)生了顯著遺傳分化，中游群體間沒有發(fā)生遺傳分化，從基因流數(shù)據(jù)看，江津群體與中游3個群體間基因流均在1與4之間(表2)，說明江津群體與中游群體間基因交流受到一定阻礙，這與王長忠[12]等運用微衛(wèi)星分子標記的研究結(jié)果一致。從單倍型上看，頻率最高的單倍型(Cytb:H_1，D-loop:Hap_2)為所有群體共享，但江津群體中頻率第二的單倍型(Cytb:H_9，D-loop:Hap_24)，只有一尾來自宜昌群體共享于H_9，同時中游群體中頻率第二的單倍型(Cytb:H_2，D-loop:Hap_7)也只有一尾來自江津群體與之共享(圖2)。比對試驗樣本發(fā)現(xiàn)，單倍型H_9和Hap_24/25/35/48是同一批樣本，在2個系統(tǒng)樹上均形成一個單獨分支(圖3)，表明這些單倍型是長江上游特有單倍型，適應(yīng)了上游生態(tài)環(huán)境，宜昌的一尾樣本很可能來自上游群體。以魚類線粒體cytb基因0.65%的突變速率[23]和控制區(qū)3.6%的突變速率[24]為基準，估算2個譜系間的分化時鐘，其分化時間為距今45 536(Cytb)-49 411(D-loop)年前，依此推測2個譜系的分化時間大約在第四紀更新世晚期，這期間溫差有12 ℃左右，推測是在地貌變化和種群演化兩方面因素影響下形成，可能是冰期和間冰期交替導(dǎo)致地理隔離與融合造成單倍型分化，使得物種形成了不同種群，種群繁衍至今有了現(xiàn)在的遺傳結(jié)構(gòu)模式。

遺傳多樣性的本質(zhì)是遺傳變異，是生命進化和物種分化的基礎(chǔ)，生物的遺傳變異有一個積累的過程，當(dāng)積累到一定程度，這些變異可能對該物種的遺傳結(jié)構(gòu)、種群分化甚至是物種的進化產(chǎn)生影響[25]。本研究結(jié)果顯示，長江上游和中游群體存在顯著遺傳分化，上游群體遺傳多樣性高于中游群體，這對以后的漁業(yè)管理工作提供了一定的理論基礎(chǔ)，例如增殖放流要謹遵“哪里來哪里放”原則，在上游增殖放流應(yīng)選用上游原種種苗，中游的只能選用中游群體原種，避免跨流域種苗放流可能帶來的潛在生態(tài)風(fēng)險。

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