方敦煌，肖炳光，焦芳嬋，曾建敏，吳興富

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明 650021

煙草黑脛病（tobacco black shank）是由卵菌Phytophthorɑ nicotiɑnɑe引起的土傳病害，在溫帶、亞熱帶和熱帶發(fā)生程度較重，是我國煙草的第二大病害[1-2]。已有研究表明，最經(jīng)濟有效的防治措施是選育和應(yīng)用抗病品種。國外抗黑脛病育種始于20世紀(jì)20年代，在育種過程中發(fā)現(xiàn)Florida 301和Beinhart 1000-1是黑脛病的抗源[3]，由于黑脛病危害的逐年增加，研究人員規(guī)?；_展了抗源的篩選，將抗黑脛病較好的野生種N. plumbɑginifoliɑ、N. longi florɑ、N.stocktonii、N. nesophilɑ和N. repɑndɑ中的抗性轉(zhuǎn)育至普通栽培煙草[4-6]，漸漸形成Florida 301、Beinhart 1000-1、Coker 371-Gold、N. plumbɑginifoliɑ和N. longi florɑ等5大抗源育種體系[3]。我國從20世紀(jì)50年代開展抗黑脛病育種以來，不懈探索抗性鑒定方法，持續(xù)開展煙草種質(zhì)資源與新品種（系）的抗病鑒定工作，但在抗源利用、抗性鑒定技術(shù)、工作程序上還有待進(jìn)一步改進(jìn)完善。本文在梳理國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身工作實踐，對煙草黑脛病的抗性鑒定研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)與展望。

1 抗性鑒定方法研究進(jìn)展

煙草黑脛病菌主要集中在0～5 cm的土層活動，對煙草的田間侵染發(fā)生于近地表的根及莖基部，偶爾由帶菌雨水飛濺侵染葉片[1-2]。煙草黑脛病的抗性鑒定是一個依據(jù)侵染特性接種病菌、觀察病癥反應(yīng)并評價的過程，按接種部位分為根部、莖部和葉部接種等3種方法[4-11]；按鑒定時期劃分為苗期和成株期2種方法；近年來，出現(xiàn)了針對特定抗源開發(fā)的分子標(biāo)記輔助抗性鑒定方法。為了與現(xiàn)行的煙草品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)[12]一致，本文按鑒定時期論述煙草黑脛病抗性鑒定方法。

1.1 苗期鑒定

苗期接種方法較多[13]，用于抗性鑒定的可歸納為菌絲塊創(chuàng)傷莖/根接種法（菌谷法）、游動孢子或菌絲體懸浮液莖注射接種法[14]（注射法）、游動孢子懸浮液浸根接種法（游動孢子浸根法）、毒素脅迫種子萌發(fā)法[15]（毒素法）等4種方法。注射法由于操作比較繁瑣、費時，難以實現(xiàn)苗期抗性鑒定的規(guī)?；?。因此，本文重點評述菌谷法、游動孢子浸根法和毒素法3種抗性鑒定方法進(jìn)展。

1.1.1 菌谷法

菌谷法于20世紀(jì)80年代初提出[16]，被煙草品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)[12]采用，并規(guī)范了抗感對照品種、菌谷接種量、病害誘發(fā)條件、病害調(diào)查方法和調(diào)查時間[17]。在實際應(yīng)用中，菌谷法不斷改進(jìn)。云南省煙草科學(xué)研究所[18]優(yōu)化了抗性指標(biāo)，將菌谷埋入煙苗莖基部接種后以第5 d、7 d和10 d共 3次病情指數(shù)的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)。貴州省煙草科學(xué)研究院[19]將菌谷埋入煙苗根部接種后3～10 d調(diào)查病情，評價抗性，大大減少了工作量。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所[20]在病菌菌絲平板上點播表面消毒的煙草種子，對萌發(fā)的種子進(jìn)行發(fā)病率統(tǒng)計、抗感水平評價，大幅度縮短了鑒定時間。

此外，菌谷法還衍生出另一種方法——莖基部創(chuàng)傷菌絲塊貼接法[21]。該方法接種時菌絲塊須準(zhǔn)確貼接在創(chuàng)傷傷口上，在確保人工創(chuàng)傷傷口大小一致[21-22]、定量菌絲塊貼接與保濕一步到位[23]的前提下，可進(jìn)行規(guī)模化篩選和驗證[24]。

1.1.2 游動孢子浸根法

游動孢子浸根法由Gooding等[25]提出，Stokes等[26]將其用于煙草品種抗性鑒定，Jaarsveld等[11]將其進(jìn)一步發(fā)展為煙草品種抗性鑒定方法，梁元存等[27]驗證其鑒定結(jié)果可靠。但以上研究在接種前需要洗凈煙草幼苗根部，對煙苗根系造成較大的傷害，接種時煙苗根部接觸游動孢子的表面積大，選擇壓力過大，存在發(fā)病偏重、中抗材料易被歸入感病類型等問題。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院[28]對此進(jìn)行了改進(jìn)，采用兩段式漂浮育苗方式[29]培育煙苗，刮根、淺盤定量浸根接種，根系創(chuàng)傷適中、接種量均一化、中感與中抗易于區(qū)分，而且鑒定對象規(guī)?；?，有效提高了鑒定的規(guī)模和效率。

1.1.3 毒素法

毒素法是根據(jù)寄主植物對毒素和病害反應(yīng)的一致性原理，用毒素代替病原物對植物品種個體、器官、細(xì)胞團(tuán)和原生質(zhì)體進(jìn)行抗性篩選的方法，可以加速抗病育種進(jìn)程[30]。煙草黑脛病菌產(chǎn)生的毒素[31]可以作為選擇壓篩選突變體[32-33]或評價抗性[34]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所[15]采用毒素液浸種，統(tǒng)計種子發(fā)芽率評價抗性，但尚需對毒素進(jìn)行定量化、優(yōu)化[35]才可高通量、快速鑒定煙草黑脛病抗性。毒素法較其他方法技術(shù)要求更高、環(huán)境條件更苛刻、操作難度大，建議作為輔助抗性鑒定方法。

1.2 成株期鑒定

成株期鑒定[12]主要在自然或人工病圃中進(jìn)行。自然病圃的初侵染源來自連作煙田的煙草黑脛病病株，而人工病圃的初侵染源主要是人工添加的煙草黑脛病菌谷物培養(yǎng)物（即菌谷），兩者均可通過灌溉維持土壤含水量的飽和狀態(tài)以誘發(fā)病害。按煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[17]規(guī)定，于發(fā)病初期、盛期、末期各調(diào)查1次，以感病對照品種病情指數(shù)最先達(dá)到60及以上的調(diào)查數(shù)據(jù)為依據(jù)進(jìn)行抗病性評價，感病對照品種病情指數(shù)不低于60時試驗及評價有效。

成株期鑒定反映了品種的實際抗性水平，是品種推廣應(yīng)用必需經(jīng)過的階段。在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行成株期鑒定時，技術(shù)細(xì)節(jié)不斷得到充實。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院明確了自然病圃選擇的條件[36]，并對接種方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用層餅式接種覆蓋形成人工病圃、間歇式保濕誘發(fā)病害，避免了環(huán)境條件對鑒定結(jié)果的影響，提高了抗性鑒定的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性[37]。

1.3 分子標(biāo)記輔助抗性鑒定

分子標(biāo)記輔助抗性鑒定法不需生物接種，可直接用于育種材料的抗性鑒定，但前提是抗源的遺傳特性明確。遺傳分析表明，N. plumbɑginifoliɑ、Coker 371-Gold和N. longi florɑ的抗性為顯性單基因控制，F(xiàn)lorida 301、Beinhart 1000-1的抗性由微效多基因控制[38-40]。Johnson等在探索Coker 371-Gold的黑脛病抗性基因來源時，鑒定出6個與黑脛病抗性連鎖的RAPD標(biāo)記[41]，并證明其可用于分子標(biāo)記輔助抗性鑒定[42]。何彬等[43]研究表明31份表型鑒定為抗性的材料中，14份含有抗性RAPD，占比45.16%，說明抗性材料的抗病基因來源比較集中。高亭亭等[44]從Beinhart 1000-1中篩選到5個與黑脛病抗性緊密相關(guān)的QTLs，陳迪文等[45]利用白肋煙抗黑脛病品種B37檢測到7個黑脛病抗性相關(guān)QTLs，這些研究結(jié)果為精細(xì)定位抗病QTL奠定了基礎(chǔ)，推動了微效多基因控制的煙草黑脛病分子標(biāo)記輔助選擇。

2 種質(zhì)資源與新品種（系）的抗病鑒定

20世紀(jì)80年代以來，我國對煙草品種抗黑脛病鑒定方法與抗性指標(biāo)進(jìn)行了探索[16]，1996年在參考國內(nèi)外煙草及其他作物品種抗病鑒定方法的基礎(chǔ)上，借助多年的實踐，制訂形成了包括煙草黑脛病在內(nèi)的4種病害抗性鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[46]，2008年修訂、提升為國家標(biāo)準(zhǔn)[12]。同時，利用行業(yè)品種區(qū)域試驗平臺，形成了南北育種中心為主的煙草品種區(qū)域試驗網(wǎng)絡(luò)[47]，并對黑脛病抗性品種審定提出了明確要求[48]，煙草品種黑脛病抗性鑒定工作由專門的鑒定單位規(guī)范進(jìn)行。

2.1 種質(zhì)資源的抗病性

為搜集和尋找煙草黑脛病抗源，20世紀(jì)80年代我國重點開展了品種資源的收集整理，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所對1000多份煙草資源進(jìn)行反復(fù)驗證，篩選出高抗黑脛病0號生理小種的資源20多份，約占1.33 %，抗病材料125份，占比8.33 %[1]。

南方育種中心自成立以來在行業(yè)品種區(qū)域試驗平臺上持續(xù)開展黑脛病抗性鑒定。許美玲等[49]采用大田病圃人工接種0號生理小種菌谷對213份資源進(jìn)行抗病鑒定，發(fā)現(xiàn)高抗品種17份、占7.98 %，中抗品種60份、占28.17 %，抗病品種48份、占22.54 %。黃成江等[50]采用菌絲塊創(chuàng)傷莖基部接種0號生理小種，在病圃測定了52份烤煙品種的抗性，結(jié)果表明高、中抗品種占30.78 %。李梅云等[51]采用苗期菌谷接種0號生理小種對146份煙草種質(zhì)開展抗性鑒定與評價，結(jié)果表明抗性種質(zhì)有118份，占比80.82 %。于海芹等[52]采用0號生理小種游動孢子浸根法對新引進(jìn)的288份煙草種質(zhì)進(jìn)行了抗性鑒定，篩選出17份抗病資源和23份中抗資源。何彬等[53]對66份煙屬野生種的黑脛?。?號及1號生理小種）抗性進(jìn)行了評價，篩選出14份抗0號生理小種、15份抗1號生理小種、11份資源兼抗0號和1號生理小種。

此外，研究人員在河南、湖南、貴州等黑脛病常發(fā)區(qū)開展了種質(zhì)資源抗性鑒定。劉風(fēng)蘭等[54]通過人工病圃鑒定，從26份材料中篩選出5份高抗資源、13份抗病資源。李艷[55]采用苗期菌谷法對26份曬煙資源進(jìn)行了抗性測定，發(fā)現(xiàn)13份抗病資源、3份中抗資源。向世鵬等[56]采用人工病圃接種1號生理小種，對49份種質(zhì)資源進(jìn)行了抗病性鑒定，結(jié)果表明24份材料表現(xiàn)為抗病、7份材料表現(xiàn)為中抗。

2.2 新品種（系）的抗病鑒定

隨著黑脛病抗性鑒定技術(shù)的成熟，抗黑脛病育種取得了顯著成效，育成的抗病品種比例大幅度提高[57-59]，引進(jìn)的抗病品種有K326[60]和NC89[61]，育成的抗病或中抗品種有云煙85[62]、云煙87[63]、中煙100[64]、龍江911[65]、云煙97[66]、南江3號[67]、云煙100[68]、秦?zé)?6[69]等，均已先后成為烤煙主栽品種，累計種植面積均已超過100000 hm2[70]。

3 問題與展望

3.1 抗源利用不足，抗性和品質(zhì)難以兼顧

煙草生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的抗源來自N. plumbɑginifoliɑ和 Florida 301。我國 抗黑脛病育種主體親本G28、K326、NC82的抗源來自Florida 301，缺乏來自N. plumbɑginifoliɑ的抗源[71]。雖然我國現(xiàn)存的煙草品種資源達(dá)到4312份[72]，但對黑脛病的抗性鑒定不夠，缺乏抗性、品質(zhì)遺傳等方面的深入研究，抗性和品質(zhì)難以兼顧。需要規(guī)模化篩選抗源、分析遺傳規(guī)律、挖掘抗病基因、篩選抗性分子標(biāo)記，采取遠(yuǎn)緣雜交、生物技術(shù)等多種方法創(chuàng)新抗源，通過復(fù)式雜交、修飾回交、混交-混選等育種體系，實現(xiàn)抗性和品質(zhì)的同步改良。

3.2 鑒定方法的技術(shù)細(xì)節(jié)需進(jìn)一步明確

國家標(biāo)準(zhǔn)方法[12]中，成株期鑒定涉及自然病圃與人工病圃。人工病圃與自然病圃相比，能夠較好地控制病菌的小種類型、致病力、數(shù)量和分布，且條件更優(yōu)越，可保證病圃發(fā)病適中，準(zhǔn)確性、重復(fù)性更好，建議在評價抗性時，以人工病圃鑒定為判別依據(jù)、自然病圃鑒定為參考。這種觀點已被煙草品種農(nóng)業(yè)試驗技術(shù)規(guī)程[47]所采用。

國家標(biāo)準(zhǔn)方法[12]中，菌谷法技術(shù)有待完善。菌谷有根部、莖基部以及根部和莖基部同時接種3種方式。田間黑脛病調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，成株期的莖基部是病菌最易受攻擊的部位、顯癥比根部快、病癥類型占絕對優(yōu)勢[1,73]，且莖基部接觸病菌時間長，在整個生長季都存在侵染的可能；而根部侵染主要發(fā)生在苗期、大田早期，地上部癥狀不明顯或者不表現(xiàn)癥狀。因此，實際操作中可以莖基部接種為主，根部以及根部和莖基部同時接種為輔。此外，游動孢子浸根法可作為標(biāo)準(zhǔn)的補充方法，毒素法可作為標(biāo)準(zhǔn)的輔助方法。

國家標(biāo)準(zhǔn)方法[12]采用了抗、中抗、感病對照，增加了鑒定結(jié)果的縱向和橫向可比性，但沒有兼顧抗、中抗品種對照，抗病評價指標(biāo)過于瑣碎，不便于國家標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的銜接。建議在病害調(diào)查時，關(guān)注抗、中抗、感病3個對照品種的發(fā)病進(jìn)程，按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的病情指數(shù)指標(biāo)評價抗性，以“感病對照品種病情指數(shù)不低于75、抗和中抗對照符合抗性評價指標(biāo)”作為試驗及評價有效的判別依據(jù)。若感病對照品種病情指數(shù)介于50～75時，可借鑒棉花黃萎病的相對抗病指數(shù)[74-75]進(jìn)行評價。當(dāng)感病對照品種病情指數(shù)低于50時，試驗及評價無效。

3.3 鑒定工作程序尚需完善

在煙草黑脛病抗性鑒定的工作中，有必要探索不同方法鑒定結(jié)果的可比性[35]、苗期與成株期鑒定的相關(guān)性。由于不同煙草品種的耐病性和恢復(fù)力不同、以及組織器官的差異[73]，一些品種苗期和成株期抗病結(jié)果不一致，因此苗期鑒定適合于大批煙草種質(zhì)和新品種（系）的抗性檢測篩查。對于即將推廣種植的重點材料仍應(yīng)進(jìn)行成株期鑒定，經(jīng)苗期篩選出的抗性材料和品種（系），需經(jīng)過成株期至少2點、2年的人工病圃鑒定，再進(jìn)行品種審定和大面積推廣。

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