周潔+溫亮+周黎+王方+矯振彪+吳金平

摘要：超低溫療法相對(duì)傳統(tǒng)脫毒方法具有操作相對(duì)容易、時(shí)間周期短、脫毒率高等優(yōu)勢(shì)。從超低溫療法原理、種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)等方面進(jìn)行了闡述，并展望了通過(guò)處理材料不同生理狀態(tài)研究、優(yōu)化預(yù)培養(yǎng)因子等技術(shù)，可有效提高超低溫療法在薯芋類(lèi)蔬菜脫毒上應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：超低溫療法；脫毒；薯芋類(lèi)蔬菜

中圖分類(lèi)號(hào)：S632 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4697-03

薯芋類(lèi)蔬菜在生產(chǎn)上多采用無(wú)性繁殖方式，易導(dǎo)致植物體內(nèi)病毒的逐代積累，致使種性退化、抗逆性下降、品質(zhì)變劣，最終導(dǎo)致大幅減產(chǎn)[1]。如生姜因種姜病毒的積累就可導(dǎo)致5%～45%的減產(chǎn)，馬鈴薯病毒一般也可導(dǎo)致20%～50%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上，僅馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)的病毒已多達(dá)25種[2]。由此可見(jiàn)，植物病毒已嚴(yán)重制約薯芋類(lèi)蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。而目前對(duì)于素有“植物癌癥”之稱(chēng)的植物病毒，國(guó)內(nèi)外卻尚無(wú)高抗病毒品種和高效殺病毒藥劑[3]。

生產(chǎn)上常采用脫毒苗來(lái)應(yīng)對(duì)病毒給農(nóng)業(yè)帶來(lái)的巨大損失，而植物組織脫毒培養(yǎng)技術(shù)是目前獲得脫毒植株最有效的方法。脫毒植株和帶毒植株相比，其光合作用、抗氧化酶活性、葉綠素含量等具有顯著差異，脫毒植株長(zhǎng)勢(shì)更好，可提升產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量[4，5]，具有明顯種性?xún)?yōu)勢(shì)。熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法等常規(guī)脫毒方法普遍存在操作困難、費(fèi)時(shí)、脫毒不完全、植株成活率低等缺點(diǎn)[6]。而基于超低溫保存的新型植物脫毒方法，即超低溫療法能很好解決以上問(wèn)題[7]。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)相比，超低溫療法脫毒率可提高23%～100%，脫毒率平均可提高53%[8]。同時(shí)，超低溫療法脫毒率不受莖尖大小影響，操作更為簡(jiǎn)便，還可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)種質(zhì)保存和病毒脫除。

1 超低溫療法原理

2006年Wang等[9]首次將超低溫保存脫毒技術(shù)定義為超低溫療法（Cryotheraphy），即基于超低溫保存對(duì)細(xì)胞的選擇性破壞原理[10]，將感染病原體（病毒、植原體、細(xì)菌）的材料經(jīng)液氮（-196 ℃）短暫處理后脫除病原體的技術(shù)[11]。同時(shí)陳芳等[12]也對(duì)超低溫療法脫毒原理進(jìn)行了解釋。超低溫療法一般選取植物莖尖，病毒一般通過(guò)維管束傳播，靠近頂端分生組織的細(xì)胞，維管束較少或尚未形成，帶毒較少，且質(zhì)合比大、液泡小、自由水含量低，超低溫保存時(shí)易脫水，不易形成冰晶，超低溫保存后易成活；而遠(yuǎn)離頂端分生組織的細(xì)胞，已形成較多維管束，帶毒量高，且核質(zhì)比小、液泡大、自由水含量高，超低溫保存時(shí)不易脫水，易形成冰晶，超低溫處理后不易成活。因此，利用莖尖組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，在進(jìn)行超低溫處理后，莖尖帶毒的組織細(xì)胞基本不能成活，而有較少病毒甚至不帶病毒的細(xì)胞得以存活，由這部分成活細(xì)胞發(fā)育成的植株可能是無(wú)毒的，由此獲得無(wú)病毒植株。前人通過(guò)該方法已成功去除了大蒜普通潛隱病毒、馬鈴薯病毒等[13，14]。

2 超低溫療法的種類(lèi)

目前，常用的超低溫療法主要包括玻璃化法、包埋脫水法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法等方法，其差異在于莖尖的玻璃化處理。趙喜亭等[15]研究表明，玻璃化超低溫療法是在超低溫保存冰凍前，將材料置于由一定比例非滲透性和滲透性保護(hù)劑組成的玻璃化溶液（PVS）進(jìn)行處理，在高降溫速率下使細(xì)胞中液體固化為無(wú)定形的玻璃化狀態(tài)，并以該狀態(tài)進(jìn)行低溫保存，該方法由于保護(hù)劑濃度高，對(duì)材料毒害作用較大，對(duì)脫水過(guò)程和保護(hù)劑滲透性需嚴(yán)格控制，且同一時(shí)間處理材料有限。而Fabre等[16]利用褐藻酸鈣將材料包埋后放置高濃度蔗糖培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，利用無(wú)菌空氣流脫水，投入液氮中貯存的包埋脫水法，彌補(bǔ)了玻璃化法的不足，但相對(duì)玻璃化法脫水時(shí)間長(zhǎng)、組織恢復(fù)生長(zhǎng)慢、部分植物材料成苗率低。包埋玻璃化法是在包埋脫水法和玻璃化法的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的，將材料放入氯化鈣和硅藻酸鹽組成的包埋液形成小球后置于玻璃化溶液中脫水，然后液氮保存[17]，該方法存活率可高達(dá)90%，脫水時(shí)間短，材料恢復(fù)生長(zhǎng)較快，方法簡(jiǎn)便易操作。而目前廣為應(yīng)用的小滴玻璃化法是一種相對(duì)較新的方法，即材料經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后用裝載液和玻璃化液對(duì)材料進(jìn)行處理，隨后將材料轉(zhuǎn)入滴有3～15 μL PVS2鋁箔條上形成小滴，再將鋁箔條放入裝有液氮的冷凍管中，然后液氮保存[18]，該方法具有存活率、再生率高、適用性廣、處理量大、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

3 超低溫療法的優(yōu)勢(shì)

與傳統(tǒng)的脫毒方法相比，超低溫療法具有明顯優(yōu)勢(shì)。首先超低溫療法的脫毒率不受莖尖大小限制，操作更簡(jiǎn)便。常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒率與莖尖大小成反比，但成活率與莖尖大小成正比[19]。因此一般切取莖尖0.2～0.4 mm，該技術(shù)對(duì)操作人員要求較高，且莖尖易褐化，成活率低。而超低溫療法細(xì)胞存活率與細(xì)胞特性相關(guān)，因此不受莖尖大小限制，操作難度大大降低。其次超低溫療法周期短。目前常用的熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒方法中，熱處理一般為30 d左右，超低溫療法通常無(wú)需熱處理，試驗(yàn)周期大大縮短。此外，超低溫療法還有脫毒率高的特點(diǎn)。利用超低溫療法可使根狀莖的PPV脫毒率達(dá)到50%，是莖尖培養(yǎng)脫毒率的2倍[20]。白建明等[21]在研究超低溫療法和其他3種常規(guī)脫毒方法比較中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖通過(guò)超低溫療法脫毒率達(dá)到59.13%，而熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法脫毒率為56.02%、熱處理法脫毒率為42.61%、莖尖培養(yǎng)法脫毒率為35.83%，同時(shí)超低溫療法的再生植株于對(duì)照植株在形態(tài)學(xué)上無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，超低溫療法較常規(guī)脫毒法操作相對(duì)容易、時(shí)間周期短、脫毒率高等，為植物脫毒提供了一條新途徑。

4 超低溫療法在薯芋類(lèi)蔬菜中的應(yīng)用

超低溫療法目前在薯芋類(lèi)蔬菜脫毒中的研究有限，多集中于種質(zhì)資源超低溫保存體系的建立和優(yōu)化。曾琳等[22]研究表明利用玻璃化超低溫保存處理的高良姜種子活力可達(dá)到72.67%。杜來(lái)順等[23]發(fā)現(xiàn)經(jīng)玻璃化超低溫保存后的生姜試管苗叢生芽成活率可達(dá)到57.7%。利用莖尖包埋玻璃化法對(duì)江西山藥多種基因型進(jìn)行超低溫保存，成活率約為40%～85%，同時(shí)再生植株的遺傳穩(wěn)定性良好[24]。采用莖尖包埋玻璃化法超低溫冷凍技術(shù)保存徐薯18號(hào)，莖尖存活率可高達(dá)85%以上[25]。經(jīng)過(guò)超低溫保存后的魔芋花粉，具有明顯的冷刺激現(xiàn)象，比新鮮花粉離體萌發(fā)率更高[26]。王子成等[27]通過(guò)超低溫療法成功脫除馬鈴薯S病毒和Y病毒，其中馬鈴薯S病毒脫毒率為47%，顯著高于莖尖培養(yǎng)法脫毒率17%，馬鈴薯Y病毒脫除率達(dá)到83%，高于莖尖培養(yǎng)法的62%。由此可見(jiàn)，薯芋類(lèi)蔬菜的無(wú)性繁殖存在種性退化、病毒積累的問(wèn)題，造成種質(zhì)優(yōu)良性狀的丟失，而超低溫療法能在保存優(yōu)良種質(zhì)資源的同時(shí)達(dá)到脫毒的目的，是一種新型高效的脫毒技術(shù)。endprint

5 展望

中國(guó)薯芋類(lèi)蔬菜資源豐富，生態(tài)類(lèi)型多樣，其種質(zhì)資源的保存以及克服生產(chǎn)上無(wú)性繁殖導(dǎo)致的病毒積累具有重要意義，因此薯芋類(lèi)蔬菜的超低溫療法體系的建立顯得十分重要。在薯芋類(lèi)蔬菜的超低溫療法研究中，該技術(shù)體系的適用性、易操作性、使用效果等需要不斷進(jìn)行優(yōu)化。不同種類(lèi)薯芋類(lèi)蔬菜以及同種蔬菜的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期狀態(tài)的不同，應(yīng)有針對(duì)性建立具有穩(wěn)定存活率和脫毒率的超低溫療法技術(shù)體系，為該技術(shù)在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支持。為了在超低溫療法中得到較高的成活率，主要通過(guò)優(yōu)化加入適宜濃度的蔗糖類(lèi)滲透保護(hù)物質(zhì)、添加水楊酸類(lèi)化學(xué)成分和低溫鍛煉等預(yù)培養(yǎng)條件，增強(qiáng)處理材料對(duì)高度脫水和劇烈溫度變化的耐受性，從而提高超低溫療法效率[28]。加強(qiáng)超低溫療法過(guò)程中組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化研究，通過(guò)對(duì)細(xì)胞水平的研究，明確處理材料不同生理狀態(tài)時(shí)超低溫處理對(duì)其影響，從而對(duì)有針對(duì)性的進(jìn)行材料的選取和預(yù)處理等條件的優(yōu)化。

綜上所述，雖然目前超低溫療法在薯芋類(lèi)蔬菜上研究處于初級(jí)階段，在植物病毒脫除的巨大潛力還有待于進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。同時(shí)對(duì)于超低溫保存和脫毒后植株遺傳穩(wěn)定性及生理生化、分子水平的變化等都將是今后的研究重點(diǎn)。隨著超低溫療法應(yīng)用研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)設(shè)施的不斷完善，其作為一種新型的種質(zhì)保存和脫除病毒技術(shù)將得到廣泛應(yīng)用。

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