陳巧玲+楊國(guó)才+程群+高劍華+徐怡

摘要：以白及（Bletilla Reichb.f.）種子為外植體，通過(guò)不同的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)與繼代生根培養(yǎng)，研究白及種子快速繁殖的最優(yōu)培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基組合為液體培養(yǎng)基1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+6.0 mg/L IAA+pH 8.2；在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA愈傷組織液體誘導(dǎo)培養(yǎng)中以1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8最佳；MS+pH 5.8培養(yǎng)基對(duì)生根較好，1/2 MS+pH 5.8對(duì)叢生芽的增殖較好；試驗(yàn)為白及建立植株繁殖體系提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白及（Bletilla Reichb.f.）； 種子；組織培養(yǎng)；快速繁殖；培養(yǎng)基配方

中圖分類號(hào)：S567.23+9.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4807-04

白及屬（Bletilla Reichb.f.）為蘭科（Orchidaceae）多年生草本植物，地下部分具肥厚的肉質(zhì)根狀莖或假鱗莖；作為中藥材有3個(gè)種，分別是華白及[B.sinensis（Rolfe）Schltr.]、黃花白及（B.ochracea Schltr.）和小白及[B. formosana（Hayata）Schltr.][1，2]。白及假鱗莖含白及膠質(zhì)（白及甘露糖）黏液（約55%），還含淀粉揮發(fā)油等成分[3]?？捎糜诎b疽瘡腫、跌打損傷、刀箭創(chuàng)傷及燙火傷治療，能生肌止痛，具美容作用，治面部痤瘡、除疥廯、止肺部出血等[4]。其不僅具有醫(yī)藥用途，同時(shí)也有極高的觀賞價(jià)值。白及在每年的9-10月蒴果由淡黃到褐色而成熟，然后破裂，散出種子；但白及的種子在自然環(huán)境中幾乎不萌發(fā)，可能與種子發(fā)育不完整有關(guān)。目前白及的栽培主要采用分株繁殖方式，繁殖系數(shù)低，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，不宜進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，白及的試管繁殖已成為可能。已經(jīng)有選用白及種子進(jìn)行無(wú)菌播種、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽培養(yǎng)的報(bào)道[5]，還進(jìn)行了白及共生菌的分離、初步鑒定和伴生菌研究，這為建立完善的白及快繁體系奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)擴(kuò)大白及栽培規(guī)模、滿足市場(chǎng)需求以及保護(hù)野生資源[6]都具有重要意義。有學(xué)者已在白及組織培養(yǎng)方面進(jìn)行了實(shí)踐，如曾宋君等[7]做了白及無(wú)菌播種及試管苗莖尖組織培養(yǎng)；田英翠等[8]進(jìn)行了白及組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究；石云平等[9]以白及側(cè)芽為外植體，進(jìn)行白及組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究，為人工栽培提供了大量種苗；余朝秀等[10]認(rèn)為煉苗基質(zhì)以60%腐葉土+30%珍珠巖+10%素紅土為佳，煉苗溫度23～27 ℃，空氣相對(duì)濕度在80%～90%有利于提高煉苗成活率。試驗(yàn)采用未成熟的白及蒴果進(jìn)行無(wú)菌播種培養(yǎng)和試管苗的組織培養(yǎng)，著重研究并篩選白及組織培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)程序，旨在建立無(wú)性繁殖體系，探索脫毒白及生產(chǎn)快速繁殖技術(shù)，這不但能在短期內(nèi)獲得大量的無(wú)病毒種苗滿足市場(chǎng)需求，而且通過(guò)放養(yǎng)有利于白及野生資源的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白及種子以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA、6-BA、IAA由恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；選取白及種子作為外植體，流水沖洗2 h后用濾紙吸干水分，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s左右，然后用0.1%的升汞振蕩消毒3 min，去離子水清洗5次，再接種到培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 外植體誘導(dǎo)愈傷組織正交試驗(yàn) 以白及種子為試驗(yàn)材料，選用MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基母液的配制及保存參考文獻(xiàn)[11]的方法。以植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、瓊脂、pH和MS稀釋倍數(shù)4因子、3水平設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。每個(gè)處理10次重復(fù)， 培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照度1 500～2 500 1x、每天光照24 h。通過(guò)以上處理誘導(dǎo)出愈傷組織后，進(jìn)行下一步繼代培養(yǎng)及叢生芽增殖培養(yǎng)。

1.2.2 繼代與生根培養(yǎng) 愈傷組織繼代與生根培養(yǎng)采用4組培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基配方如下：Ⅰ組固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基為MS+pH 5.8；Ⅱ組固體培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+pH 5.8；Ⅲ組固體培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+pH 5.8；Ⅳ組固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基為1/2 MS+pH 5.8。每組10次重復(fù)，比較各組對(duì)白及愈傷組織繼代與生根培養(yǎng)的影響。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 對(duì)繼代與生根培養(yǎng)出來(lái)的外植體通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別增殖培養(yǎng)，使已分化的外植體再次脫分化，誘導(dǎo)出更多的叢生芽。以1/2 MS （pH 5.8）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同組合的6-BA、NAA，各處理組合見(jiàn)表2，每處理10個(gè)重復(fù)。比較不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽增殖的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，白及愈傷組織生長(zhǎng)狀況與瓊脂數(shù)量關(guān)系密切，在瓊脂為0的處理中，愈傷組織誘導(dǎo)成活率較高，其次是與MS培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)相關(guān)。在瓊脂為0（即液體培養(yǎng)基）的處理1、處理4、處理7這3個(gè)處理中，愈傷組織誘導(dǎo)成活率分別為80%、70%、90%，均處于較高水平；從表3中還可以看出，1/2MS培養(yǎng)基的處理（處理2、處理6、處理7）其愈傷組織具有較高的誘導(dǎo)成活率，分別為70%、50%、90%。最佳的為處理7，即1/2 MS+6.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA+0 g瓊脂+pH 8.2，其誘導(dǎo)成活率為90%。

2.2 繼代與生根培養(yǎng)

白及愈傷組織繼代與生根培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4。對(duì)繼代與生根培養(yǎng)的Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組生長(zhǎng)情況進(jìn)行單一比較，以及Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組、Ⅳ組兩兩之間進(jìn)行生長(zhǎng)情況比較，結(jié)果見(jiàn)表4。從圖1、圖2、圖3、圖4、表4可知，在Ⅱ組、Ⅲ組中加入了0.5 mg/L NAA 后，根的產(chǎn)生極少，說(shuō)明NAA對(duì)根的生長(zhǎng)具有抑制作用，且對(duì)外植體的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)也有抑制作用；1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)利于白及外植體不定芽的形成，進(jìn)而可形成其他器官[12]；MS利于白及外植體根及地上部分的形成。endprint

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)白及叢生芽增殖的情況見(jiàn)圖5。由圖5可以看出，生長(zhǎng)最佳的是A2組、A4組、C4組，其培養(yǎng)基組成分別為1/2 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+pH 5.8；以A4組的叢生芽增殖成活率最高，達(dá)85%。從圖5還可見(jiàn)，由A2組至B3組叢生芽的增殖成活率是遞減的，而從B3組至A4組則呈現(xiàn)出遞增的變化趨勢(shì)，隨著6-BA、NAA單因素各濃度的增加，叢生芽增殖成活率有增有減。說(shuō)明低濃度的6-BA、NAA與高濃度的6-BA、NAA均有利于叢生芽進(jìn)一步向莖葉方向的分化，這可能跟低濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有利于植株的生長(zhǎng)、高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑會(huì)導(dǎo)致植株死亡有關(guān)[13]。

3 小結(jié)與討論

3.1 種子組織培養(yǎng)與種子萌發(fā)優(yōu)劣比較

本次試驗(yàn)培養(yǎng)出來(lái)的白及幼苗采用的種子也許會(huì)有種子本身萌發(fā)潛力[14]的干擾，為此，將其與種子萌發(fā)做一比較。首先，種子萌發(fā)注重種子的完整性，種子的結(jié)構(gòu)不完整以及生理準(zhǔn)備物質(zhì)不足將使繁殖系數(shù)極低，影響整個(gè)植株的生長(zhǎng)潛力。而采用組織培養(yǎng)不但可以避免這方面的不利，并且可以通過(guò)重復(fù)使誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織建立起量大的繁殖體系，這就大大提高了繁殖系數(shù)。其次，自然狀態(tài)下，白及種子極小，加之會(huì)遇到惡劣的自然環(huán)境，用種子很難繁殖出新的植株；而組織培養(yǎng)可在室內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，通過(guò)煉苗，提高了植株對(duì)外界不良環(huán)境的抵御能力。

3.2 瓊脂濃度與白及愈傷組織形成及發(fā)育的關(guān)系

培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在瓊脂濃度相對(duì)較低的培養(yǎng)瓶中外植體容易形成比較好的愈傷組織，愈傷組織膨大、團(tuán)狀；在瓊脂濃度相對(duì)較高的培養(yǎng)瓶里愈傷組織相對(duì)較小。這一現(xiàn)象的原因可能是：第一，在一定營(yíng)養(yǎng)成分濃度的培養(yǎng)環(huán)境中，有利于愈傷組織的形成，不管是何種成分，只要濃度達(dá)到，產(chǎn)生有利于愈傷組織形成的膨壓（位置效應(yīng)）[15]，就能誘導(dǎo)愈傷組織的形成；第二，跟瓊脂本身一定濃度的成分相關(guān)，瓊脂中的某些成分在其濃度較低時(shí)，促進(jìn)愈傷組織的形成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞分裂；第三，培養(yǎng)基的凝膠狀態(tài)模擬了細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，利于細(xì)胞的分裂、分化。

3.3 外植體成活率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而遞減

外植體隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率呈遞減趨勢(shì)，其原因有二：一是外植體本身具有一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)于另一培養(yǎng)基里時(shí)，自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可維持其生長(zhǎng)一段時(shí)間；二是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，外植體在增殖的過(guò)程中大量消耗營(yíng)養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)物消耗殆盡時(shí)，植株的成活率自然降低。

3.4 外植體聯(lián)合現(xiàn)象

在少部分愈傷組織中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，各個(gè)獨(dú)立的愈傷組織出現(xiàn)聯(lián)合生長(zhǎng)[16]的現(xiàn)象，進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，聯(lián)合的愈傷組織猶如一個(gè)沒(méi)分開(kāi)過(guò)的整體，出現(xiàn)一部分長(zhǎng)莖、一部分長(zhǎng)根的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因：一是外植體的同源性，外植體均為同種親本，又處于愈傷組織環(huán)境中，具有識(shí)別作用的糖蛋白相同；二是細(xì)胞間的融合作用。依據(jù)此現(xiàn)象可以對(duì)外植體形成的愈傷組織分開(kāi)進(jìn)行不同的誘導(dǎo)方向培養(yǎng)，讓其一部分長(zhǎng)莖、長(zhǎng)葉，一部分長(zhǎng)根，一部分依然是愈傷組織；待長(zhǎng)出不同的器官后，在同一培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)融合培養(yǎng)，發(fā)揮愈傷組織起聯(lián)合的橋梁作用。

3.5 培養(yǎng)基物理狀態(tài)對(duì)組織培養(yǎng)的影響

從整個(gè)試驗(yàn)處理來(lái)看，當(dāng)用于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，液體培養(yǎng)的效果明顯高于固體培養(yǎng)；當(dāng)用于繼代培養(yǎng)時(shí)，固體培養(yǎng)的效果又相對(duì)較好，使植株生長(zhǎng)健壯。原因可能是液體具有流動(dòng)性，外植體吸收養(yǎng)分更方便、更快捷，提供了有利于細(xì)胞增殖的環(huán)境；固體利于繼代培養(yǎng)可能是固體對(duì)外植體的分化提供了一個(gè)理想的分化環(huán)境，對(duì)外植體還具有固定作用，使細(xì)胞的分化能夠穩(wěn)定進(jìn)行；此外，這里的固相屬于凝膠狀態(tài)，具有跟細(xì)胞液相似的內(nèi)環(huán)境，從而使分化更容易進(jìn)行。

試驗(yàn)通過(guò)L9（34）正交設(shè)計(jì)，篩選出最佳誘導(dǎo)白及種子愈傷組織的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+6.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA+0 g瓊脂+pH 8.2，瓊脂濃度為零即培養(yǎng)基的狀態(tài)為液體狀態(tài)；此外，在繼代培養(yǎng)后又進(jìn)行的叢生芽增殖培養(yǎng)中，誘導(dǎo)出的叢生芽生長(zhǎng)最好的培養(yǎng)基配方仍為液態(tài)下的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其配方分別為1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ pH 5.8、1/2 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+pH 5.8，它們均有利于白及種子愈傷組織形成后的叢生芽增殖，說(shuō)明NAA與6-BA不同濃度的配比對(duì)白及種子愈傷組織的誘導(dǎo)成活率和叢生芽增殖存在著協(xié)同效應(yīng)。MS+pH 5.8培養(yǎng)基對(duì)生根作用較好，1/2 MS+pH 5.8對(duì)叢生芽的增殖效果較好。NAA屬于生長(zhǎng)素類，生長(zhǎng)素對(duì)器官建成的作用最明顯的表現(xiàn)是在促進(jìn)根原基形成及生長(zhǎng)上，所以NAA在對(duì)根的誘導(dǎo)培養(yǎng)中具有促進(jìn)生根作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志第十四卷種子植物[M].北京：科學(xué)出版社，2003.

[2] 曹春林.中藥鑒定學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.139.

[3] 謝宗萬(wàn).全國(guó)中草藥匯編上冊(cè)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.285-286.

[4] [明]李時(shí)珍，著.俞小平，黃志杰，譯.本草綱目精譯[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[5] 韋卡婭，劉燕琴，秦 靜，等.白及組培外植體的篩選研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2008，5（10）：13-14.

[6] 郭巧生.藥用植物栽培學(xué)[M].北京.高等教育出版社，2006.

[7] 曾宋君，黃向力，陳之林，等.白及的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)研究[J].中藥材，2004，27（9）：625-627.

[8] 田英翠，袁雄強(qiáng).白芨組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（4）：75-77.

[9] 石云平，李 鋒，凌征柱.白芨組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，40（11）：1408-1410.

[10] 余朝秀，李枝林，王玉英.野生白芨組培快繁技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，27（5）：601-604.

[11] 錢(qián)子剛.藥用植物組織培養(yǎng)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007.

[12] 黃宗戴.植物組織培養(yǎng)及其在生物技術(shù)上的應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，1983.162.

[13] 李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)[M].第二版.北京：高等教育出版社， 2006.

[14] 張建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關(guān)系[J].亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（4）：32-35.

[15] 龍春林，程治英，王 俐，等.蘭州百合器官離體培養(yǎng)外植體位置效應(yīng)觀察[J].云南植物研究，2004，26（2）：221-225.

[16] 肖尊安.植物生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.endprint