陳海龍+高曉輝+翟丹云+趙莉莉+李赟+楊曉麗+董延虎

摘要：以藍(lán)莓為原料，藍(lán)莓花青素含量為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計法優(yōu)化檸檬酸提取藍(lán)莓花青素的工藝。驗證試驗確定了檸檬酸提取藍(lán)莓花青素最佳提取工藝，即檸檬酸濃度為30%，料液比（g/mL）為1∶15，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。在最優(yōu)工藝下花青素含量為3.62 mg/g。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；花青素；檸檬酸；正交試驗法

中圖分類號：TQ914 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4859-04

藍(lán)莓為杜鵑花科多年生灌木，其果實呈深藍(lán)色，被白霜，含有豐富的花青素和維生素等活性成分[1]。花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而形成花青素，作為一種天然色素分布廣泛，存在于許多水果中，如紫薯、葡萄、桑甚、藍(lán)莓等。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用花青素可明顯改善視力、減緩老年斑的沉積、促進(jìn)心肺等功能[2，3]，且能延緩皮膚衰老，有效預(yù)防感染性疾病和降低早期奧本海默癥狀的患病風(fēng)險，對由糖尿病引起諸多疾病有輔助治療作用[4，5]。因為花青素具有明顯的保健功效，使得富含花青素的原料被作為營養(yǎng)加強劑添加到食品中[6，7]。藍(lán)莓富含花青素，可作為藥食兩用水果進(jìn)一步開發(fā)成具有降血脂的保健食品和藥品[8]。提取藍(lán)莓中的花青素主要使用鹽酸酸化的醇類，而花青素多用于食品，檸檬酸既是食品添加劑又是藥物工業(yè)原料。鑒于鮮見到檸檬酸提取藍(lán)莓花青素的相關(guān)報道，本試驗以藍(lán)莓為原料，研究檸檬酸濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對藍(lán)莓花青素中主要成分矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）[9]含量的影響，運用正交試驗法優(yōu)化檸檬酸提取藍(lán)莓花青素的工藝，旨在為開發(fā)藍(lán)莓花青素功能性食品藥品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)莓購自蘭州市場，按1∶5比例加水打漿冷藏備用；純水自制；檸檬酸（上?；瘜W(xué)試劑廠），批號830905；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）（ChromaDex公司），純度96.4%，批號528-58-5。

XS225A型電子分析天平普利塞斯，瑞士；優(yōu)普UPT-I-20L落地式純水機(jī)四川優(yōu)普超純科技；UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的提取工藝 準(zhǔn)確稱取打漿藍(lán)莓5.000 g，加入一定體積的檸檬酸溶液，在一定溫度下加熱，振蕩，抽濾、定容[10]。

1.2.2 花青素含量的測定 通過紫外分光光度計測定，以C3G作為對照品，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算法計算，花青素含量以C3G計[11，12]。

花青素含量=（n×v×f）/M，其中，n為樣品濃度， v為樣品體積，f為稀釋倍數(shù)，M為藍(lán)莓漿質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗 固定檸檬酸濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）30%，藍(lán)莓果漿與檸檬酸溶液料液比1∶10（g/mL）、溫度30 ℃、提取60 min的情況下，改變另外的因素水平，檸檬酸濃度（g/mL）為10%、20%、30%、40%、50%；料液比（g/mL）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；溫度為30、40、50、60、70 ℃；提取時間為30、60、90、120、150 min；進(jìn)行單因素試驗，以C3G吸光度為指標(biāo)，擇優(yōu)參數(shù)。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 采用SPSS 19.0軟件，在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)置水平，以檸檬酸濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素的3個水平設(shè)計正交試驗L9（34）優(yōu)化檸檬酸提取藍(lán)莓花青素工藝。

1.2.6 藍(lán)莓中花青素含量測定 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：準(zhǔn)確稱取C3G標(biāo)準(zhǔn)品（純度96.4%）0.005 06 g，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇，制成含C3G 0.975 6 mg/mL的儲備液溶液。

樣品溶液配制：準(zhǔn)確吸取按照“1.2.1”制備的樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇，待測。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，分析試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，對各組結(jié)果采用Duncans法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素含量測定

2.1.1 檢測波長的選擇 取C3G標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行紫外全波長掃描。由圖1可知，C3G在可見光區(qū)域520 nm處有最大吸收，可見光區(qū)域520 nm處為其特征吸收，所以本試驗在520 nm波長處檢測C3G的含量。

2.1.2 線性關(guān)系考察 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，進(jìn)行紫外分光測定。以吸光度（y）對C3G的質(zhì)量濃度（x）（mg/mL）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果（圖2）顯示，C3G在0～0.08 mg范圍內(nèi)與吸光度相關(guān)性較好，回歸方程為y=22.161x+0.006 4，R2=0.998 8。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 檸檬酸濃度對藍(lán)莓花青素吸光度的影響 結(jié)果（圖3）顯示，其他條件不變時，藍(lán)莓花青素的吸光度隨檸檬酸濃度的增加而增加。當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)30%時，吸光度最大，與其他濃度相比，差異顯著，這是因為花青素在酸性條件下呈穩(wěn)定的紅色。檸檬酸濃度較小時，pH較高，花青素不溶于溶液；當(dāng)檸檬酸濃度過大，花青素吸光度有所降低，由于酸性較強引起花青素水解，導(dǎo)致含量下降[13，14]?？紤]其穩(wěn)定性，防止花青素水解。因此選擇檸檬酸濃度20%～40%為正交試驗因素水平。

2.2.2 料液比對藍(lán)莓花青素吸光度的影響 由圖4可知，藍(lán)莓花青素吸光度隨著料液比的提高呈增加趨勢。當(dāng)料液比>1∶5時，藍(lán)莓花青素吸光度大幅提高，說明花青素向提取液擴(kuò)散速率變快，充分溶解，溶解量增大。而料液比繼續(xù)增加，花青素吸光度變化不大，料液比超過1∶10吸光度基本不變，說明花青素溶解速率達(dá)到平衡，因此料液比選擇1∶10～1∶20為正交試驗因素水平。endprint

2.2.3 提取溫度對藍(lán)莓花青素吸光度的影響 由圖5可知，藍(lán)莓花青素吸光度隨著提取溫度的增長呈上升趨勢。溫度升至40 ℃時，粗提液中藍(lán)莓花青素吸光度最高。隨著溫度進(jìn)一步升高，藍(lán)莓花青素吸光度開始下降，超過50 ℃吸光度顯著下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是溫度低，花青素溶出不完全，導(dǎo)致含量較低，然而花青素是熱敏性色素，在高溫下不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變[15]，所以升高到一定溫度，部分花青素發(fā)生分解，使得花青素吸光度降低。因此選擇30～50 ℃為正交試驗因素水平。

2.2.4 提取時間對藍(lán)莓花青素含量的影響 由圖6可知，隨著提取時間的延長，藍(lán)莓花青素吸光度呈上升趨勢，在30～90 min內(nèi)花青素增加較快，超過120 min花青素含量不再上升，說明120 min左右花青素提取達(dá)到平臺期。隨著提取時間的增加，花青素被分解，吸光度略有下降。因此，試驗選擇60～120 min為正交試驗因素水平。

2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇4個影響因素的3個水平設(shè)計正交試驗L9（34）優(yōu)化檸檬酸提取藍(lán)莓花青素工藝，考察指標(biāo)為花青素含量，正交試驗結(jié)果見表2，正交試驗最優(yōu)工藝為A2B2C3D1。

方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，檸檬酸提取藍(lán)莓花青素的影響因素中檸檬酸濃度的影響極顯著，提取溫度、料液比和提取時間次之，影響不顯著。極差分析結(jié)果中得出的最佳工藝是A2B2C3D2，即檸檬酸濃度為30%，料液比為1∶15，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。

2.4 驗證試驗

由于極差分析最優(yōu)工藝與正交試驗結(jié)果最優(yōu)工藝不一致，正交試驗最優(yōu)工藝為A2B2C3D1，而極差分得出的最佳工藝是A2B2C3D2，所以需進(jìn)行驗證試驗。以上述兩組最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果表明，極差分析最優(yōu)工藝下提取液花青素含量為3.62 mg/g， RSD=1.08%（n=6），正交試驗最優(yōu)工藝下提取液花青素平均含量為3.57 mg/g，RSD=0.58%（n=6）。根據(jù)提取率選擇極差分析的最優(yōu)工藝A2B2C3D2。

3 小結(jié)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用正交試驗法優(yōu)化了檸檬酸提取藍(lán)莓花青素的工藝條件。在正交試驗設(shè)計所選條件范圍內(nèi)，檸檬酸濃度對藍(lán)莓花青素含量的影響最大，其次為提取溫度，然后是提取時間，料液比影響最小。驗證試驗確定檸檬酸提取花青素的最佳工藝參數(shù)為檸檬酸濃度為30%，料液比為1∶15 g/mL，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。最優(yōu)工藝下花青素含量為3.62 mg/g。

花青素作為一種天然水溶性食用色素，不僅色澤鮮艷、安全、無毒，而且還具有良好的營養(yǎng)和保健功效，在食品、化妝品、醫(yī)藥等方面已顯示出巨大的應(yīng)用潛力[16]。藍(lán)莓作為花青素含量最豐富的資源之一，研究其提取分離和開發(fā)利用具有重要的意義。隨著人們生活水平的提高。對天然產(chǎn)品的需求量越來越大。天然的花青素主要作為食品藥品中間體，提取多采用鹽酸酸化的醇類、冰乙酸等溶劑提取[15，17]。冰乙酸氣味刺激性較大，對食品口感影響較大。檸檬酸作為食品添加劑無色無味，對后期花青素的應(yīng)用影響較小，本試驗采用檸檬酸作為新的提取溶劑，旨在為藍(lán)莓花青素資源的開發(fā)和利用提供新方法。

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