王鋒+武蕓

摘要：通過對蛇足石杉（Huperzia serrata）的組織培養(yǎng)進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立蛇足石杉的快速繁殖體系。結(jié)果表明，100 mg/L AAS+0.5 mg/L孔雀石綠組合對蛇足石杉外植體內(nèi)生菌的抑制效果較好，外植體存活率為20%。蛇足石杉初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g/L+瓊脂4.59 g/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L+山農(nóng)一號0.05%+TDZ 0.3 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)80%；繼代培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)在MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D的條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)70%；誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為 1/3MS+1.5 mg/L IBA+2.0 mg/L谷氨酰胺，生根率可達(dá)90%。

關(guān)鍵詞：蛇足石杉（Huperzia serrata）；組織培養(yǎng)；快速繁殖；愈傷組織

中圖分類號：S791.27；S722.37 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4888-04

蛇足石杉（Huperzia serrata）為石杉科石杉屬蕨類植物[1-6]，由于富含石杉堿甲，能增強(qiáng)記憶、抗老年性癡呆等[7-11]。為了獲取石杉堿甲而無節(jié)制地采挖，加上其生長極其緩慢，致使蛇足石杉資源快速減少，因此開展蛇足石杉快速繁殖技術(shù)研究很有必要的。由于其植株中內(nèi)生真菌豐富，蛇足石杉組培技術(shù)雖有學(xué)者進(jìn)行了探索[12]，但效果不佳，重復(fù)性差，用組織培養(yǎng)的方法探索蛇足石杉最佳培養(yǎng)條件仍然是亟待解決的問題。本研究建立蛇足石杉組培快繁體系，為解決藥用蕨類植物蛇足石杉原料缺失瓶頸提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：蛇足石杉采自湖北省中藥材研究所的藥材基地（恩施市長嶺崗）。

試劑：MS基本培養(yǎng)基、0.1%升汞、無水乙醇、TDZ、2，4-D、谷氨酰胺、蔗糖、蒸餾水、孔雀石綠、瓊脂、IBA、KT、山農(nóng)一號、AAS（30 mg/L青霉素、50 mg/L鏈霉素和125 μg/L兩性霉素配制而成）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 選取蛇足石杉的嫩莖尖、莖段、葉片，將蛇足石杉的莖段切成1～2 cm的小段，清洗干凈并流水沖洗24 h。在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗1次，濾紙吸干水；再用0.1%升汞對莖段、莖尖、葉片分別消毒殺菌6.0、3.5、3.5 min，用無菌水清洗5次，最后在0.05%山農(nóng)一號溶液中浸泡9 min，接種于添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，在25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的條件下培養(yǎng)10 d。按以下公式計(jì)算誘導(dǎo)率：誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體的塊數(shù)×100%。

1.2.2 外植體內(nèi)生菌的防治 將外植體表面消毒并培養(yǎng)10 d未被染菌的莖尖移入到MS培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基中添加孔雀石綠（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）和AAS（0、50、100、500 mg/L）的組合濃度進(jìn)行內(nèi)生菌滅菌，共有16個(gè)處理組，每個(gè)處理20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體。在25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的條件下培養(yǎng)20 d。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 用初代培養(yǎng)存活下來的蛇足石杉莖尖外植體在MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖20 g/L+瓊脂4.59 g/L+谷氨酰胺0.3 g+碳粉2 g/L+赤霉素0.5 mg/L。以TDZ（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）和2，4-D（1.0、2.0、3.0 mg/L）的組合濃度在MS培養(yǎng)基中，選出適合蛇足石杉腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，共15個(gè)處理組，每個(gè)組接種20瓶，每瓶接種2個(gè)外植體。在溫度25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的條件下培養(yǎng)30 d后觀察結(jié)果。

1.2.4 蛇足石杉生根培養(yǎng)基的改善 選用莖尖外植體作為材料處理，選擇MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS作為基本的生根培養(yǎng)基，并組合不同濃度的IBA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）組合，共20個(gè)組合，每個(gè)組合接種10瓶，每瓶接種1株，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。在基本培養(yǎng)基中添加20 g/L蔗糖和0.1 mg/L谷氨酰胺。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

本試驗(yàn)從單因子到兩兩組合使用IBA、KT、TDZ、谷氨酰胺4種植物生長調(diào)節(jié)劑添加在MS培養(yǎng)基上，觀察誘導(dǎo)效果。

2.1.1 IBA的誘導(dǎo)效應(yīng) 由表1可知，IBA對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)效果顯著，在濃度為0.05 μg/L時(shí)誘導(dǎo)率最高，其愈傷組織成黃綠色、疏松狀，生長勢較好。

2.1.2 KT的誘導(dǎo)效應(yīng) 由表2可知，KT對蛇足石杉的愈傷組織的誘導(dǎo)效果不明顯，且為深黃綠色、疏松的愈傷組織，長勢也比較差。當(dāng)濃度為1.4 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率最高，但都出現(xiàn)了一定程度的染菌，在當(dāng)褐化中KT的濃度越高時(shí)其褐化就越嚴(yán)重，生長勢也越差。

2.1.3 TDZ的誘導(dǎo)效應(yīng) 由表3可知，TDZ對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)。TDZ濃度為0.3 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率最高，其愈傷組織的為淡綠色、疏松狀，其長勢比KT的生長要好一些。

2.1.4 2，4-D的誘導(dǎo)效應(yīng) 2，4-D對蛇足石杉的愈傷組織的誘導(dǎo)效果見表4，為淡綠色、疏松的愈傷組織。其中當(dāng)2，4-D濃度為1 mg/L其誘導(dǎo)效果相對較好，但仍然有不同程度的染菌，染菌顏色呈純白色菌色，2，4-D的濃度越高時(shí)其褐化程度就越嚴(yán)重。

2.1.5 TDZ與IBA組合對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 由表5可知，TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L組合對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)較好，其生長勢也相對較好的，愈傷組織成綠色、疏松、膨大組織，但還是有不同程度的染菌。endprint

由表6顯示，TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L對蛇足石杉的誘導(dǎo)率可以達(dá)到80%，比TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L組合的誘導(dǎo)率要高。但染菌程度比較嚴(yán)重的，多種植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出現(xiàn)的玻璃化程度較高。

2.2 不同外植體對蛇足石杉愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

由表7可知，不同外植體在愈傷組織誘導(dǎo)中誘導(dǎo)效率不一樣，從高到底依次是莖尖、葉片、莖段。誘導(dǎo)率分別是莖尖75%、葉片65%、莖段45%。莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織碧綠、膨大、疏松，而葉片和莖段的愈傷組織的誘導(dǎo)效果不很明顯，生長勢也不好，染菌也比較嚴(yán)重，所以最適合的外植體部位為莖尖。

2.3 不同孔雀石綠和AAS組合對內(nèi)生菌的防治效果

研究結(jié)果（表8）顯示，當(dāng)孔雀石綠濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，不論AAS濃度為多少時(shí)外植體沒有被感染都是全部死亡，濃度為1.0 mg/L的孔雀石綠致使外植體全部死亡。在沒有孔雀石綠的情況下，AAS濃度為100 mg/L和150 mg/L時(shí)，其具有一定的滅菌能力，但是滅菌效果差，染菌的外植體數(shù)太多。在沒有AAS下孔雀石濃度在0.5 mg/L時(shí)也具有一定的殺菌力度，但是染菌數(shù)目還是較大。當(dāng)AAS和孔雀石綠一定濃度組合共同殺菌比其中單獨(dú)一種殺菌效果要好，當(dāng)AAS濃度為50 mg/L和孔雀石綠為0.5 mg/L組合、100 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石綠組合共同殺菌，外植體存活率都為20%，但是在50 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石綠滅菌條件下還是具有真菌，只是真菌的生長速度有所減慢。因此，在蛇足石杉外植體內(nèi)生菌殺滅中使用100 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石綠組合消毒殺菌效果較好，經(jīng)這種方式消毒殺菌后將外植體置于黑暗條件下2 d后再放置弱光下培養(yǎng)效果更好。

2.4 蛇足石杉試管苗的繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明（表9），在TDZ為2.5 mg/L時(shí)，愈傷組織萌發(fā)數(shù)為0，誘導(dǎo)率也為0，可以得出在TDZ為2.5 mg/L時(shí)，因濃度過高導(dǎo)致不能夠讓愈傷組織萌發(fā)。TDZ濃度不變的條件下，隨著2，4-D的濃度升高愈傷組織萌發(fā)數(shù)減少，誘導(dǎo)率也不斷下降，因此2，4-D為1 mg/L處時(shí)誘導(dǎo)率最高；2，4-D濃度不變時(shí)，愈傷組織萌發(fā)數(shù)和誘導(dǎo)率會隨著TDZ濃度升高先升高后降低。所有處理中誘導(dǎo)率最高為70%，即在1.0 mg/L TDZ和1 mg/L 2，4-D組合的條件下最適合蛇足石杉愈傷組織的萌發(fā)。

2.5 蛇足石杉生根培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

由表10可知，7、10、11、12號處理的生根率比較高，分別達(dá)到70%、70%、80%、70%，尤其是11號的生根率最高，達(dá)到了80%。在IBA濃度不變的條件下，1/3MS培養(yǎng)基都比較適合幼苗的生根。當(dāng)培養(yǎng)基不變的條件下，生根率先隨著IBA的濃度升高而升高，在到達(dá)IBA濃度為1.5 mg/L時(shí)生根率達(dá)到最大，隨后隨著IBA濃度的增加生根率反而下降。在培養(yǎng)基為1/3MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，IBA濃度為1.5 mg/L是生根率最好，然后用11號的組合加上2.0 mg/L谷氨酰胺會使生根率達(dá)到90%。因此，蛇足石杉幼苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/3MS培養(yǎng)基并加上1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L谷氨酰胺。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，蛇足石杉外植體內(nèi)生菌的抑制較好組合為100 mg/L AAS+0.5 mg/L孔雀石綠；在初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的研究中均取得了一定的進(jìn)展，蔗糖20 g/L+瓊脂4.59 g/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L+0.05%山農(nóng)一號+TDZ 0.3 mg/L作為初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基效果較好；繼代培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D效果較好；誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為1/3MS中添加1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L谷氨酰胺效果較好。

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