稀土礦城市不同季節(jié)大氣可吸入顆粒物中稀土含量特征及顆粒物細(xì)胞毒性

童亞莉，李可欣，田舒菡,3，梁濤,3,*

1. 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院，北京 100190 4. 北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所，北京 100054

從20世紀(jì)60年代初，經(jīng)過(guò)50多年的發(fā)展，中國(guó)已成為世界上最大的稀土生產(chǎn)國(guó)、稀土產(chǎn)品消費(fèi)國(guó)和出口國(guó)。隨著稀土資源的大量開(kāi)發(fā)，稀土元素(rare earth elements, REEs)不可避免地通過(guò)各種方式和途徑進(jìn)入到環(huán)境中[1]。稀土粉塵進(jìn)入人體后，對(duì)人體存在著一定的致病作用，毒性的大小與稀土元素的形態(tài)、濃度等有關(guān)[2]。已有流行病學(xué)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，長(zhǎng)期的稀土環(huán)境暴露，會(huì)加重人體肝、腎負(fù)擔(dān)，并對(duì)人體的某些免疫功能產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[3]。距離稀土礦區(qū)越近的居住區(qū)兒童智商均數(shù)、記憶力均較對(duì)照組明顯低下，并且重稀土可能比輕稀土更易在大腦蓄積或毒性更大[4-6]。稀土粉塵通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體內(nèi)，大部分粉塵沉積在呼吸道和肺部組織，引發(fā)炎癥，嚴(yán)重者患上塵肺病和間質(zhì)性肺病等疾病[7]。劉建國(guó)等[2]對(duì)稀土粉塵作業(yè)人員檢查發(fā)現(xiàn)，肺功能異常率顯著高于對(duì)照組。從事稀土金屬生產(chǎn)的工人有呼吸道及皮膚病變、肺纖維性變、血小板下降等病狀[8]，尿液中稀土含量顯著高于對(duì)照組[9]。鄒彤彤等[10]對(duì)CeO2、包鋼混合稀土、硅鐵合金、Y2O2及富釔5種粉塵的細(xì)胞毒性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5種粉塵均具有一定的細(xì)胞毒性，并具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。Ma等[11]對(duì)小鼠進(jìn)行CeO2納米顆粒物注射發(fā)現(xiàn)，肺泡 巨噬細(xì)胞分泌的IL-12和IFN-γ增多，表明CeO2納米顆粒物會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生不利影響。Cassee等[12]通過(guò)對(duì)小鼠注射Ce-DEP顆粒物同樣發(fā)現(xiàn)，Ce-DEP暴露增加了小鼠腦部和肝臟的促炎癥因子水平。

包頭市是典型的稀土礦工業(yè)城市，擁有全球最大的輕稀土礦——白云鄂博稀土礦[13]。大規(guī)模的稀土開(kāi)采、冶煉和加工，以及干燥、少雨、多強(qiáng)風(fēng)的天氣狀況，造成了包頭市嚴(yán)重的大氣顆粒物污染和大氣環(huán)境中高稀土背景值。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大氣顆粒物的細(xì)胞毒性研究多關(guān)注以北京、天津?yàn)榇淼牡葯C(jī)動(dòng)車(chē)保有量大、二次污染嚴(yán)重的大中城市，缺乏對(duì)工業(yè)城市尤其是以礦產(chǎn)資源開(kāi)發(fā)為主的城市的大氣顆粒物研究[14-16]。隨著稀土資源的開(kāi)采和利用程度越來(lái)越高，環(huán)境和人類暴露增加，對(duì)稀土與人體健康的研究尤為重要。因此，本研究采集了典型稀土礦工業(yè)城市包頭市春、夏季的PM10樣本，將人肺上皮A549細(xì)胞暴露于PM10顆粒物樣品和標(biāo)準(zhǔn)顆粒物1649b(Standard reference material, SRM1649b)，從細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激和DNA損傷3個(gè)方面來(lái)研究包頭PM10對(duì)A549細(xì)胞暴露后所產(chǎn)生的毒性作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

PM10采樣器(嶗應(yīng)2036，青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所，中國(guó))，石英纖維濾膜(MK360，Munktell公司，瑞典)，超聲清洗器(Branson 1510，Branson公司，美國(guó))，離心旋轉(zhuǎn)冷凍蒸發(fā)儀(Power Dry-RC1010，Thermo Scientific公司，美國(guó))，電感耦合等離子體質(zhì)譜(IPC-MS，ELAN DRC-e, Perkin Elmer公司，美國(guó))，電子天平(Sarius CP225D，Sartorius AG公司，德國(guó))，電熱板(DRB07-600B，濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司，中國(guó))，超純水器(UPW-20S，北京歷元電子儀器貿(mào)易公司，中國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERACELL 150i, Thermo Scientific公司，美國(guó))，顯微鏡(CX23，Olympus公司，日本)，24/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(φ=15.6 mm 和4.5 mm，Corning公司，美國(guó))，細(xì)胞計(jì)數(shù)器(CASY?1，Innovatis公司，美國(guó))，超凈臺(tái)(Holten LaminAir, Holm & Halby公司，丹麥)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo Scientific公司，美國(guó))，熒光和化學(xué)發(fā)光分析儀(Fluoroskan AscentTMFL，Thermo Scientific公司，美國(guó))，熒光顯微鏡(CKX41，Olympus公司，日本)，SRM1649b(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)協(xié)會(huì))，GelBond?膜(Cambrex, Medinova Scientific A/S, Hellerup，丹麥)，F(xiàn)-12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，谷酰胺(Gibco公司)，青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)(Gibco公司)，Hank’s溶液(Gibco公司)、Triton X-100(Gibco公司)，WST-1試劑(曼海姆，德國(guó))，2'7'-二氯熒光素二醋酸鹽(2’7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)溶液(Gibco公司)，硝酸、氫氟酸、高氯酸(優(yōu)級(jí)純，北京化工廠)。

1.2 樣品采集和處理

1.2.1 大氣顆粒物樣品的采集

PM10分別采集于包頭典型稀土礦地區(qū)4個(gè)具有代表性的功能區(qū)(圖1)，分別為白云鄂博礦區(qū)、工業(yè)區(qū)、包頭市中心區(qū)和包頭市居住區(qū)。采集時(shí)間為2014年4月和2013年8月。采樣濾膜為石英纖維濾膜，采樣流速為100 L·min-1，采樣期間如遇到雨水天氣，則需等雨停3 d之后再進(jìn)行采集。采樣后，用干凈鑷子將樣品膜取出，對(duì)折放入鋁箔中，密封好，帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-20 °C 冰箱保存，用于后續(xù)顆粒物提取。

1.2.2 大氣顆粒物提取

將載有顆粒物的石英纖維濾膜對(duì)折，沿垂直于折疊線的方向?qū)V膜剪成兩半，將其中一半濾膜放入50 mL塑料管中，加入20～50 mL甲醇保證濾膜被全部沒(méi)過(guò)，放入超聲清洗器中超聲30 min后，將管中甲醇轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中，在冷凍離心旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)甲醇得到顆粒物。稱取離心管蒸發(fā)前后的質(zhì)量得到所提取顆粒物的質(zhì)量，提取率約為81%。石英纖維濾膜對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mg顆粒物中最高有25%為石英纖維。根據(jù)采樣日期，將分別采集于4個(gè)功能區(qū)的PM10提取物混合為2個(gè)PM10暴露樣品(PM10-春季，PM10-夏季)。

分別稱取5 mg大氣顆粒物(PM10-春季、PM10-夏季、SRM1649b)，加入5 mL含2%PBS的無(wú)菌水，配制成1 mg·mL-1母液于4 ℃冷藏備用。在細(xì)胞活性測(cè)定中，使用F-12培養(yǎng)基稀釋顆粒物母液，在細(xì)胞內(nèi)ROS和DNA損傷測(cè)定中，使用Hank’s溶液稀釋顆粒物母液。

圖1 包頭市區(qū)位和采樣點(diǎn)位圖Fig. 1 The location of Baotou City and sampling sites

1.3 顆粒物稀土元素含量測(cè)定

稱取約0.5 mg顆粒物，放入聚四氟乙烯坩堝底部，用潔凈的移液管加入適量的硝酸、高氯酸和氫氟酸(硝酸:高氯酸:氫氟酸為2:2:1)，蓋上坩堝蓋子，靜置過(guò)夜，進(jìn)行消解。采用ICP-MS分別檢測(cè)春季和夏季PM10中14種稀土元素含量。電感耦合等離子質(zhì)譜儀的元素分析條件如下：寶石噴嘴十字交叉霧化器，耐氫氟酸Scott型霧室，EPA檢測(cè)器，射頻發(fā)生器功率為1.1 kw，霧化氣(氬氣)流量為0.83 L·min-1，輔助氣(氬氣)流量為1.2 L·min-1，溶液提升量為1.2 mL·min-1。用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的操作條件測(cè)定樣品溶液和空白對(duì)照溶液，扣去空白即得樣品稀土元素含量。

1.4 細(xì)胞及其培養(yǎng)

A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國(guó))，用含10%胎牛血清、谷酰胺和雙抗溶液的F-12培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)形成的單層達(dá)到80%以上時(shí)，加入5 mL PBS溶液清洗細(xì)胞，然后加入1.5 mL胰蛋白酶消化液并放入培養(yǎng)箱中消化5 min，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)，加入10～15 mL培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞脫離瓶壁，轉(zhuǎn)移90%的細(xì)胞懸液于15 mL離心管中用于細(xì)胞暴露試驗(yàn)，剩下的10%細(xì)胞懸液加入10～15 mL培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。試驗(yàn)中采用10代以內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞活性測(cè)定

細(xì)胞活性用WST-1法進(jìn)行測(cè)定[17]。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化、稀釋后的細(xì)胞懸液接種于96孔全透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·孔-1，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。隨后棄掉上清液，將顆粒物暴露液按25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1以100 μL·孔-1加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄掉所有細(xì)胞上清液后加入100 μL·孔-1稀釋后的WST-1試劑(使用培養(yǎng)基按100 μL培養(yǎng)基中含10%WST-1試劑稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。隨后取出96孔板在酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度(測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，參考波長(zhǎng)為630 nm)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行對(duì)照，3個(gè)空白對(duì)照，3個(gè)纖維對(duì)照(纖維對(duì)照濃度為25 μg·mL-1)和3個(gè)陰性對(duì)照(Triton X-100)，實(shí)驗(yàn)于不同日期重復(fù)4次。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平用2’7’二氯熒光素二醋酸鹽(2’7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行測(cè)定[18]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化、稀釋后的細(xì)胞懸液，取100 μL·孔-1接種于96孔底部透明黑色細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·孔-1，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄掉上清液，加入100 μL·孔-1DCFH-DA染色劑于37 ℃、5%CO2條件下染色15 min，使用PBS 200 μL·孔-1清洗細(xì)胞，隨后將顆粒物暴露液按25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1以100 μL·孔-1加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。隨后取出96孔板在熒光和化學(xué)發(fā)光分析儀中測(cè)定吸光度(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行對(duì)照，3個(gè)空白對(duì)照，3個(gè)纖維對(duì)照(纖維對(duì)照濃度為25 μg·mL-1)和3個(gè)陰性對(duì)照(黑炭，10 μg·mL-1)，實(shí)驗(yàn)于不同日期重復(fù)4次。

1.7 細(xì)胞DNA損傷測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度用彗星實(shí)驗(yàn)測(cè)定[19]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化、稀釋后的細(xì)胞懸液接種于24孔全透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)·孔-1，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄掉上清液，將包頭春季PM10和夏季PM10按100 μg·mL-1以0.5 mL·孔-1加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞5 min，待細(xì)胞均脫離細(xì)胞培養(yǎng)板底部后將每個(gè)孔里的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中。所有離心管保證低溫環(huán)境，避免其他條件造成細(xì)胞DNA損傷。用1%的瓊脂糖將凝膠格子粘貼到GelBond膜的親水表面，取75 μL細(xì)胞懸液加入600 μL 0.75%的瓊脂糖中，充分混合，分別取120 μL均勻地平鋪在凝膠格子中，將所有凝膠格子于4 ℃放置15 min。將凝膠格子從GelBond膜上分離下來(lái)，并將GelBond膜浸泡到裂解液(2.5 mol·L-1NaCl, 0.1 mol·L-1Na2EDTA, 10 mmol·L-1Trisma base, pH 10, 1% Triton X-100)中，于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。取出GelBond膜，用無(wú)菌水清洗涂有樣品的表面3～5次，然后將GelBond膜置于電泳槽中，將新配制的電泳緩沖液(1 mmol·L-1Na2EDTA, 300 mmol·L-1NaOH, pH>13)倒入電泳槽中，保證液面高于GelBond膜表面，于4 ℃環(huán)境中靜置40 min。調(diào)整電泳槽中電泳緩沖液的液面高度，至電壓為25 V，電流為300 mA。打開(kāi)電泳槽開(kāi)關(guān)，電泳20 min。取出GelBond膜放置于中和緩沖液(0.4 mol·L-1Tris base, pH 7.5)中浸泡15 min，隨后放入96%乙醇中過(guò)夜。每個(gè)樣品加入50 μL的染色劑YOYO-1 (YOYO?-1 iodide)進(jìn)行染色，將載玻片輕輕的蓋在GelBond膜表面，盡量使染色劑平鋪到整個(gè)膜表面，待染色劑干透后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞DNA遷移拖尾情況，根據(jù)DNA拖尾程度按1～5類分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，總數(shù)為100個(gè)。根據(jù)調(diào)整校正曲線將計(jì)數(shù)結(jié)果按公式轉(zhuǎn)換為106堿基對(duì)(base pairs, bp)中損傷數(shù)量[19]。DNA損傷實(shí)驗(yàn)設(shè)定2個(gè)平行對(duì)照，于不同日期重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果(Results)

2.1 春季和夏季PM10中稀土元素污染特征

包頭典型稀土礦城市春季和夏季PM10和標(biāo)準(zhǔn)顆粒物SRM1649b中稀土元素質(zhì)量濃度如表1和圖2所示。包頭春季和夏季PM10中稀土元素總量(∑REE)分別為(564.20±87.87) mg·kg-1、(1 145.10±323.91) mg·kg-1，分別為SRM1649b中稀土元素總量的3.46倍和7.02倍。SRM1649b中重稀土元素(heavy rare earth elements, HREEs)(除釓Gd、鋱Tb)含量高于包頭PM10中的含量。包頭春季和夏季PM10中輕、重稀土含量比(LREE/HREE)分別為15.19和25.26，稀土元素以輕稀土為主，其中Ce、Pm和Nd含量占稀土總量的50%以上。包頭PM10呈現(xiàn)明顯的輕稀土元素富集。

從顆粒物來(lái)源來(lái)看，包頭PM10中稀土含量及組成呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性差異。包頭夏季PM10中稀土總量高于春季PM10，約為其2倍。除銩(Tm)、鐿(Yb)和镥(Lu)3種稀土元素以外，夏季PM10中其他稀土元素含量均高于春季PM10。

2.2 春季和夏季PM10對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

包頭春季和夏季不同濃度PM10染毒A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活性如圖3所示。由圖可知，A549細(xì)胞暴露于25 μg·mL-1纖維24 h后，細(xì)胞活性水平為98.4%，與空白對(duì)照相比細(xì)胞活性沒(méi)有明顯下降，表明試驗(yàn)中纖維對(duì)A549細(xì)胞的活性并沒(méi)有明顯的影響。A549細(xì)胞暴露于包頭春季、夏季PM10和SRM1649b不同濃度水平(25，50，100 μg·mL-1)24 h后，細(xì)胞活性均有不同程度的下降，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。較高暴露濃度(50，100 μg·mL-1)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用，100 μg·mL-1暴露下細(xì)胞活性水平與25 μg·mL-1時(shí)的細(xì)胞活性水平相比顯著降低(P<0.05)。與SRM1649b相比，包頭夏季PM10抑制細(xì)胞活性更加明顯，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；與包頭春季PM10相比，夏季PM10對(duì)細(xì)胞活性的抑制程度更高。

2.3 春季和夏季PM10對(duì)A549細(xì)胞ROS水平的影響

表1 包頭典型稀土礦城市春季和夏季PM10和SRM1649b中稀土元素質(zhì)量濃度Table 1 The concentration of rare earth elements(REEs) on the PM10 of Baotou City in spring and summer and SRM1649b

注：HREE和LREE分別為重、輕稀土元素。

Note： HREE stands for heavy rare earth elements, LREE stands for low rare earth elements.

A549細(xì)胞暴露于包頭春季和夏季不同濃度PM103 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平如圖4所示。由圖可知，A549細(xì)胞暴露于25 μg·mL-1石英纖維3 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平為89.1%，與空白對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，表明試驗(yàn)中石英纖維并沒(méi)有刺激A549細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS。A549細(xì)胞暴露于包頭春季、夏季PM10和SRM1649b不同濃度水平(25，50，100 μg·mL-1) 3 h后，包頭夏季PM10和SRM1649b刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，但包頭春季PM10引起細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量先增加后下降。與SRM1649b相比，包頭春季PM10在較低暴露濃度水平(25 μg·mL-1)時(shí)誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS，在較高暴露濃度水平(50，100 μg·mL-1)時(shí)誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平低于SRM1649b，當(dāng)顆粒物濃度分別為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1時(shí)，SRM1649b誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS分別比春季PM10多2.56%和45.63%；包頭夏季PM10在不同暴露濃度水平下產(chǎn)生的ROS水平均低于SRM1649b。在較低暴露濃度水平(25 μg·mL-1)時(shí)，包頭春季PM10誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，比夏季PM10多32.76%；而在較高暴露濃度水平(50，100 μg·mL-1)時(shí)，包頭夏季PM10誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，分別比春季PM10多3.99%和9.63%。

圖2 包頭典型稀土礦城市春季和夏季PM10和SRM1649b中稀土元素質(zhì)量濃度Fig. 2 The concentration of REEs on the PM10 of Baotou City in spring and summer and SRM1649b

圖3 包頭春季、夏季PM10，SRM1649b和石英纖維(25 μg·mL-1)不同暴露濃度水平下A549細(xì)胞活性水平注： *表示與纖維對(duì)照組-25 μg·mL-1相比在P<0.05水平下顯著差異；不同字母表示不同處理組之間在P<0.05水平下差異顯著。Fig. 3 The WST-1 level of A549 cells after exposure to PM10-Spring, PM10-Summer, SRM1649b and fiber (25 μg·mL-1) at different PM concentrationsNote: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.

2.4 春季和夏季PM10對(duì)A549細(xì)胞DNA損傷的影響

A549細(xì)胞暴露于100 μg·mL-1濃度的包頭春季、夏季PM103 h后，DNA雙鏈損傷程度如圖5所示。與春季PM10相比(0.86±0.13)，夏季PM10造成A549細(xì)胞產(chǎn)生更多雙鏈損傷(1.12±0.13)，約為春季PM10雙鏈損傷的1.3倍。與Frikke-Schmidt等[17]試驗(yàn)所得的陽(yáng)性對(duì)照、黑炭(100 μg·mL-1)和Jantzen等[20]試驗(yàn)所得的SRM2975、SRM1650(100 μg·mL-1)相比，包頭PM10在相同暴露濃度和暴露時(shí)間下，對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生更多DNA雙鏈損傷(圖5)，其中包頭春季PM10產(chǎn)生的雙鏈損傷程度約為SRM1650的2.5倍。

2.5 春季和夏季PM10中輕稀土元素與細(xì)胞毒性的關(guān)系分析

圖4 包頭春季、夏季PM10，SRM1649b和石英纖維(25 μg·mL-1)不同暴露濃度水平下A549內(nèi)活性氧物種(ROS)產(chǎn)生水平注： *表示與纖維對(duì)照組25 μg·mL-1相比在P<0.05水平下顯著差異；不同字母表示不同處理組之間在P<0.05水平下差異顯著。Fig. 4 The reactive oxygen species (ROS) level of A549 cells after exposure to PM10-Spring, PM10-Summer, SRM1649b and fiber (25 μg·mL-1) at different PM concentrations Note: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.

圖5 暴露于顆粒物100 μg·mL-1 3 h后細(xì)胞雙鏈DNA損傷程度注： *表示與對(duì)照組相比在P<0.05水平下顯著差異；不同字母表示不同處理組之間在P<0.05水平下差異顯著。Fig. 5 The DNA damage of A549 cells after exposure to PM at 100 μg·mL-1 for 3 hNote: * presents significantly different compared to fiber control at P<0.05 level; different letters present significantly different at P<0.05 level among different treatments.

圖7 大氣顆粒物稀土元素與細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平相關(guān)性分析注： 圖中數(shù)字的絕對(duì)值越大代表與細(xì)胞活性相關(guān)性越高，數(shù)字絕對(duì)值越小代表與細(xì)胞活性相關(guān)性越小。Fig. 7 The correlation analysis of REEs on PM and ROS productionNote: The bigger the absolute value is, the larger the correlation is.

由于包頭PM10富集輕稀土元素，因此本文主要分析包頭PM10和SRM1649b中輕稀土元素與A549細(xì)胞活性和ROS產(chǎn)生水平的相關(guān)性，結(jié)果分別如圖6、7所示。各輕稀土元素均與細(xì)胞活性呈負(fù)相關(guān)性，除La(-0.64)以外，其他6種輕稀土元素Eu(-0.96)、Sm(-0.95)、Pm(-0.89)、Nd(-0.89)、Pr(-0.86)和Ce(-0.83)相關(guān)性較高。

各輕稀土元素均與細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平呈負(fù)相關(guān)性。其中，La(-0.85)、Ce(-0.66)和Pr(-0.62)3種輕稀土元素與ROS產(chǎn)生水平相關(guān)性較高。

3 討論(Discussion)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，城市大氣顆粒物污染已成為城市大氣環(huán)境污染的重要組成類型。PM10作為城市大氣顆粒物污染主要污染物之一，是一種由可溶性鹽、金屬元素、有機(jī)物質(zhì)和生物組分等組成的混合物質(zhì)，成分及來(lái)源復(fù)雜。已有研究和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，稀土粉塵對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響，因此本研究采集典型稀土礦工業(yè)城市——內(nèi)蒙古包頭市春、夏季大氣PM10，表征其稀土元素含量及組成，并將人肺上皮A549細(xì)胞暴露于PM10和標(biāo)準(zhǔn)顆粒物SRM1649b，從細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激和DNA損傷3個(gè)方面來(lái)研究包頭大氣PM10對(duì)A549細(xì)胞的毒性效應(yīng)。

包頭春、夏季PM10表現(xiàn)出輕稀土富集特征，并呈現(xiàn)季節(jié)性差異，這與包頭市不同季節(jié)顆粒物來(lái)源、氣象條件和地理特征有關(guān)。包頭PM10中稀土元素平均質(zhì)量濃度從高到低的順序?yàn)椋篊e > La > Nd > Pr > Sm > Gd > Dy > Er > Yb > Eu> Tb > Ho > Tm ≈ Lu，這與白云鄂博礦區(qū)周邊土壤[21]、動(dòng)物和植物樣品中的稀土元素組成相似[22-23]。包頭白云鄂博礦區(qū)是中國(guó)最大的鐵-氟-稀土綜合礦床，其中稀土資源以輕稀土為主[24]。從稀土資源的開(kāi)采到加工，大量高輕稀土含量的粉塵排放到大氣環(huán)境中，同時(shí)，包頭干旱少雨，裸露地相對(duì)較多，揚(yáng)塵污染相對(duì)較嚴(yán)重，導(dǎo)致包頭PM10中輕稀土元素含量較高。與包頭春季PM10相比，夏季PM10中稀土元素除Tm、Yb和Lu 3種重稀土元素以外，其他稀土元素含量均高于春季PM10。春季采樣期間，遇到兩場(chǎng)降雨，降雨有效地降低了礦區(qū)礦坑粉塵進(jìn)入大氣環(huán)境的可能性。夏季包頭市盛行東風(fēng)(出現(xiàn)頻率9.8%)，春季盛行西風(fēng)(出現(xiàn)頻率為12.0%)，春季風(fēng)速全年最大[13]。包頭春季風(fēng)速較大、氣旋活動(dòng)頻繁，故春季多風(fēng)沙天氣，大量外源沙塵稀釋PM10中稀土元素含量，導(dǎo)致包頭春季PM10中大部分稀土元素含量低于夏季。Wang和Liang[25]發(fā)現(xiàn)，輕稀土更容易富集于細(xì)顆粒物上，重稀土更容易富集在粗顆粒物上，所以春季PM10中Tm、Yb和Lu 3種重稀土元素含量高于夏季PM10，而輕稀土元素含量則低于夏季PM10。

結(jié)果表明，包頭春、夏季大氣PM10和SRM1649b均引起A549細(xì)胞活性下降，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量增加，與春季相比，夏季PM10對(duì)細(xì)胞活性的抑制程度更高，表現(xiàn)出具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。從單位細(xì)胞活性水平產(chǎn)生的ROS量來(lái)看，包頭春、夏季PM10分別為1.52和1.75，也能證明夏季PM10使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的能力強(qiáng)于春季PM10。與SRM1649b相比，包頭春季PM10抑制細(xì)胞水平與SRM1649b無(wú)明顯差異，而較高暴露濃度下SRM1649b相比于包頭夏季PM10誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，這可能與SRM1649b中其他成分有關(guān)。包頭PM10與SRM2975、SRM1650[20]和黑炭[17]相比，包頭PM10造成A549細(xì)胞更多的DNA雙鏈損傷，其中夏季PM10比春季PM10造成更多的雙鏈損傷而表現(xiàn)出更強(qiáng)的遺傳毒性，這與Stieb等[26]使用meta分析方法得出的溫暖月份的PM10的呼吸系統(tǒng)疾病致死率更高結(jié)論一致。

包頭春、夏季大氣PM10和SRM1649b均引起A549細(xì)胞活性下降，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量增加，含稀土大氣顆粒物的毒性顯著高于標(biāo)準(zhǔn)顆粒物。與春季相比，包頭夏季PM10對(duì)細(xì)胞活性的抑制程度更高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。本研究的結(jié)果表明，大氣PM10能夠通過(guò)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞活性下降和DNA損傷，而顆粒物中的微量稀土元素，尤其是輕稀土元素促進(jìn)了顆粒物的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。但由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的局限，目前無(wú)法實(shí)現(xiàn)PM10上稀土元素的剝離，因而還無(wú)法單獨(dú)討論P(yáng)M10上稀土組分的毒性效應(yīng)，下一步研究需要更加關(guān)注稀土元素而不是原狀大氣顆粒物的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

致謝：包頭可吸入大氣顆粒物樣品由中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所李可欣老師提供，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在丹麥哥本哈根大學(xué)公共健康學(xué)院Peter M?ller教授課題組幫助下完成。

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