張倩倩，喬敏,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)是一種含氯有機(jī)物，被廣泛用作農(nóng)藥和木材防腐劑等；在我國(guó)，PCP及其鈉鹽常被用于殺滅血吸蟲的中間宿主——釘螺，以防治血吸蟲病[1]。PCP的廣泛使用，引起了嚴(yán)重的污染問題，在水、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)中以及一些生物體內(nèi)都有檢出[1-4]。PCP具有致癌性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等[5-6]。目前，對(duì)PCP毒理效應(yīng)的研究主要集中在大鼠、斑馬魚、大型溞等生物上[5, 7-8]，對(duì)土壤無脊椎動(dòng)物的研究較少。

在土壤生態(tài)毒理學(xué)的研究中，跳蟲是一種常用的模式生物[9]。跳蟲的存活率、繁殖和回避行為等指標(biāo)，可被用于指示污染物的毒性[10-11]。Crouau等[11]研究了PCP對(duì)跳蟲的繁殖毒性，在暴露時(shí)間為33～34 d時(shí)，繁殖抑制EC50為87 mg·kg-1。此外，跳蟲分子水平上的指標(biāo)，也越來越多地被用于生態(tài)毒理學(xué)的研究中[12-15]。與存活率、繁殖等毒性終點(diǎn)相比，分子水平上的指標(biāo)一般更敏感，反應(yīng)更快。

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S Transferase, GST)等是常用的分子生物標(biāo)志物。CYP450和GST都是代謝轉(zhuǎn)化酶，CYP450是一相代謝酶，GST是二相代謝酶，它們?cè)谕庠次镔|(zhì)的代謝和解毒方面起重要作用[13-14, 16-17]。 有研究報(bào)道，菲能誘導(dǎo)跳蟲CYP450和GST基因的表達(dá)[13-14]。PCP能被人的CYP450 3A4轉(zhuǎn)化為四氯對(duì)苯二酚[18]；四氯對(duì)苯二酚能消耗谷胱甘肽，造成氧化損傷[19]。在PCP降解菌中，PCP被氧化為四氯對(duì)苯二酚后，會(huì)被GST轉(zhuǎn)化為2,6-二氯對(duì)苯二酚，再經(jīng)其他氧化還原酶作用轉(zhuǎn)化為3-氧代己二酸[20]。

內(nèi)分泌干擾物能影響生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而影響生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等。已有一些研究表明PCP具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[5-6, 21-22]，但少有PCP對(duì)土壤無脊椎動(dòng)物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究。跳蟲作為一種節(jié)肢動(dòng)物，在其整個(gè)生命過程中持續(xù)蛻皮[23]。節(jié)肢動(dòng)物的蛻皮是由激素控制的，目前對(duì)節(jié)肢動(dòng)物蛻皮過程已有一些研究，發(fā)現(xiàn)一些蛻皮相關(guān)基因，但對(duì)跳蟲蛻皮相關(guān)基因表達(dá)的研究很少，內(nèi)分泌干擾物暴露下跳蟲蛻皮相關(guān)基因表達(dá)變化更鮮有報(bào)道。

本文以人工土壤為暴露介質(zhì)，研究了不同濃度PCP暴露下，跳蟲蛻皮相關(guān)基因、CYP450和GST基因表達(dá)水平的變化，以期為PCP等內(nèi)分泌干擾物的生態(tài)毒性和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試生物為白符跳(Folsomiacandida)，來自挪威國(guó)家農(nóng)業(yè)與環(huán)境研究所(Bioforsk)，在本實(shí)驗(yàn)室持續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方法如下：跳蟲飼養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，底部有0.5 cm厚的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由熟石膏、活性炭和蒸餾水(質(zhì)量比為9:1:7)混合后制成。培養(yǎng)皿放在人工氣候箱(寧波江南RXZ-380D)中，控制溫度為(20±1) ℃，濕度為(70%±5%)，黑暗培養(yǎng)。每周補(bǔ)充蒸餾水以保持培養(yǎng)基濕潤(rùn)，并加入少量干酵母作為跳蟲食物。實(shí)驗(yàn)中選用的跳蟲需經(jīng)過同齡化培養(yǎng)，同齡化方法如下：挑選50～60只活躍成蟲至新培養(yǎng)基中，加入少量干酵母，待成蟲產(chǎn)卵(約2 d)后，移去成蟲，每天觀察，當(dāng)觀察到有幼蟲孵出后，將幼蟲轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中培養(yǎng)。跳蟲培養(yǎng)到23 d大時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

主要試劑為PCP(純度98%，ULTRA scientific, USA)和丙酮(色譜純，F(xiàn)isher Chemical, USA)，石英砂(Sigma-Aldrich)，高嶺土(化學(xué)純，滬試)，泥炭(德國(guó)Klasmann泥炭土876型)等。

1.2 暴露方法

本實(shí)驗(yàn)中的暴露介質(zhì)為人工土壤，配制方法為：將泥炭、高嶺土和石英砂按照1:2:7的質(zhì)量比混合均勻，用CaCO3調(diào)節(jié)pH至(6.0±0.5)。配制不同濃度的PCP的丙酮溶液，加入到人工土壤中，攪拌混合均勻，使各處理組中PCP濃度分別為0、30、60、120和240 mg·kg-1干土，每個(gè)處理組做3個(gè)重復(fù)。加入一定量蒸餾水調(diào)節(jié)土壤含水量至土壤最大持水量的50%，分裝至100 mL燒杯中(每個(gè)燒杯放入30 g濕土)。每個(gè)燒杯中加入30只23 d大的跳蟲，用封口膜將燒杯封口，2 d后，用水浮法取出跳蟲，放入離心管中，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3 基因表達(dá)水平測(cè)定

跳蟲RNA的提取利用微量樣品總RNA提取試劑盒(天根)，操作按試劑盒的說明書進(jìn)行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA的完整性，利用Nanodrop測(cè)定RNA濃度，提取的RNA的OD260/OD280值在1.8～2.1范圍內(nèi)。利用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后將各個(gè)cDNA樣本稀釋10倍備用。定量PCR反應(yīng)在iCycle IQ2(Bio-rad, USA)儀器上進(jìn)行，使用SuperRealPreMix Plus試劑盒(天根)。反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μL的2×SuperReal PreMix Plus，2 μL的cDNA模板，6.8 μL的ddH2O，正向引物和反向引物各0.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s并采集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；并設(shè)置溶解曲線以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性?；虮磉_(dá)水平采用2-ΔΔCT法計(jì)算[24]。

待測(cè)的基因及其引物如表1所示。部分基因的引物序列來自于已發(fā)表文獻(xiàn)。對(duì)于基因Fcc04073和Fcc01306，根據(jù)其EST序列，利用Beacon Designer 8設(shè)計(jì)引物。對(duì)新設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用2×Taq PCR MasterMix(天根)，反應(yīng)體系為50 μL，包括：25 μL的2×Taq PCR MasterMix，5 μL的cDNA模板，16 μL的ddH2O，正向引物和反向引物各2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，進(jìn)行TA克隆，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因片段比對(duì)后確認(rèn)為需要的目的基因。各對(duì)引物qPCR擴(kuò)增效率利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定，從各個(gè)cDNA樣本中取出一部分混合作為模板，進(jìn)行5倍梯度稀釋，共5個(gè)梯度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)滿足(或經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后滿足)正態(tài)性(Shapiro-Wilk檢驗(yàn))和方差齊性(Levene檢驗(yàn))的前提下，進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，利用Dunnett's t 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性和方差齊性，則利用Kruskal-Wallis單因素方差分析。數(shù)據(jù)分析和繪圖利用SPSS 20.0和Origin 8.5完成。

2 結(jié)果(Results)

表1 qPCR中各個(gè)基因的引物Table 1 Primers used in the qPCR analysis

注：a根據(jù)Blastx和interPro注釋結(jié)果，獲得基因功能；bFcc02512(YWHAZ)被用作內(nèi)參基因。

Note：aFunction is derived from the annotation results of Blastx and interPro;bFcc02512(YWHAZ) is used as reference gene.

圖1 PCP暴露對(duì)跳蟲基因表達(dá)的影響(“*”)指該處理組與對(duì)照組相比差異顯著，P<0.05)Fig. 1 Effects of PCP on gene expression of F. candida (“*”) denotes significant difference between treated and control groups, P<0.05)

PCP對(duì)跳蟲的CYP450、GST基因和蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響如圖1所示。CYP450基因Fcc01651、Fcc02155和Fcc03650的表達(dá)水平和PCP暴露濃度之間的效應(yīng)-劑量關(guān)系不顯著(P>0.05)。隨著PCP濃度的增加，F(xiàn)cc01651的表達(dá)水平先上下波動(dòng)，后有逐漸增加的趨勢(shì)；Fcc02155的表達(dá)水平先增加，后上下波動(dòng)；Fcc03650的表達(dá)水平整體上呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)；但這些變化都不顯著(P>0.05)。

跳蟲GST基因Fcc04073和Fcc05260的表達(dá)水平與PCP暴露濃度之間的效應(yīng)-劑量關(guān)系不顯著(P>0.05)。在PCP濃度較高時(shí)，F(xiàn)cc04073(120 mg·kg-1)和Fcc05260(120 mg·kg-1和240 mg·kg-1)的表達(dá)水平高于對(duì)照組，但并不顯著(P>0.05)。在PCP濃度為30、60和120 mg·kg-1時(shí)，F(xiàn)cc00494的表達(dá)水平與對(duì)照組相近；在PCP濃度為240 mg·kg-1時(shí)，GST基因Fcc00494的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，為對(duì)照組的2.18倍。

在PCP濃度為30 mg·kg-1和60 mg·kg-1時(shí)，幾丁質(zhì)酶基因Fcc00881的表達(dá)水平略有降低；在PCP濃度為120 mg·kg-1和240 mg·kg-1時(shí)，F(xiàn)cc00881的表達(dá)受到顯著抑制，分別為對(duì)照組的40.95%和28.89%(P<0.05)。隨著PCP濃度的增加，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因Fcc01306的表達(dá)水平逐漸下降；在PCP濃度為120 mg·kg-1和240 mg·kg-1時(shí)，F(xiàn)cc01306的表達(dá)受到顯著抑制，分別為對(duì)照組的13.11%和4.20%(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

CYP450是一相代謝酶，它是一類含血紅素的依賴NADPH的單加氧酶，催化許多物質(zhì)的氧化代謝[29]。菲暴露2 d和7 d均發(fā)現(xiàn)能顯著誘導(dǎo)跳蟲CYP450基因的表達(dá)[13-14]。在本實(shí)驗(yàn)條件下，跳蟲CYP450基因Fcc01651、Fcc02155和Fcc03650并未受到PCP的顯著影響?；虮磉_(dá)會(huì)受暴露時(shí)間等的影響，本實(shí)驗(yàn)的暴露時(shí)間為2 d，這些CYP450基因的表達(dá)未發(fā)生顯著變化，可能因?yàn)楸┞稌r(shí)間較短。

GST是二相代謝酶，它廣泛存在于各種好氧生物體內(nèi)，在抗氧化、外源物質(zhì)的代謝和解毒方面起著重要的作用[30]。GST可以通過促進(jìn)還原脫氯化氫作用或與還原性谷胱甘肽的結(jié)合反應(yīng)，將疏水性的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親水性的物質(zhì)，從而更易于排出體外；此外，在有毒物質(zhì)的代謝過程中可能產(chǎn)生氧自由基，GST在氧自由基的去除過程中起重要作用[31]。有研究報(bào)道，Cd[32]、吡蟲啉[12]和菲[13-14]等顯著誘導(dǎo)了跳蟲GST基因的表達(dá)。PCP能對(duì)背角無齒蚌(Anodontawoodiana)產(chǎn)生氧化脅迫，誘導(dǎo)GST基因的表達(dá)[33-34]。本研究結(jié)果表明，PCP顯著誘導(dǎo)了跳蟲GST基因Fcc00494的表達(dá)，可能是因?yàn)镚ST參與了PCP的代謝，或者PCP引發(fā)了氧自由基的產(chǎn)生，GST參與了氧自由基的去除。跳蟲GST基因Fcc04073和Fcc05260有被PCP誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢(shì)，但并不顯著(P>0.05)，PCP對(duì)不同跳蟲GST基因(Fcc00494、Fcc04073和Fcc05260)作用不同，這可能是因?yàn)椴煌珿ST之間存在著差異，具有不同的特異性和親和性[30-31]。Nota等[13]利用基因芯片研究菲暴露下跳蟲基因表達(dá)譜的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在暴露于濃度為24.95 mg·kg-1(干土)的菲時(shí)，跳蟲GST基因Fcc00494、Fcc04073和Fcc05260都顯著上調(diào)，但上調(diào)的程度不同。

蛻皮是跳蟲重要的生命過程，影響著跳蟲的生長(zhǎng)和繁殖。跳蟲在其一生中持續(xù)蛻皮，每次蛻皮會(huì)更新其表皮和中腸上皮，圍食膜是中腸上皮的一部分[35-38]。跳蟲表皮和圍食膜的主要成分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)[35-37, 39]。幾丁質(zhì)酶在蛻皮過程中起著降解幾丁質(zhì)的作用[40]。有研究報(bào)道，在干旱脅迫下，跳蟲停止蛻皮，幾丁質(zhì)酶基因Fcc00881的表達(dá)顯著下調(diào)，在補(bǔ)水后，跳蟲恢復(fù)蛻皮，幾丁質(zhì)酶基因Fcc00881的表達(dá)顯著上調(diào)[28]。幾丁質(zhì)結(jié)合域是一些圍食膜蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)酶的組成部分[41-44]。本研究結(jié)果表明，PCP顯著抑制了跳蟲幾丁質(zhì)酶基因Fcc00881和幾丁質(zhì)結(jié)合域基因Fcc01306的表達(dá)，說明PCP可能抑制了跳蟲的蛻皮。已有報(bào)道表明PCP對(duì)水生節(jié)肢動(dòng)物大型溞(Daphniamagna)的蛻皮有抑制作用[7]，且雌二醇、乙烯雌酚和4-壬基酚等內(nèi)分泌干擾物也會(huì)抑制大型溞的蛻皮[45]。蛻皮又主要是由蛻皮激素調(diào)控的，PCP對(duì)蛻皮的抑制可能是通過干擾蛻皮激素進(jìn)行調(diào)控。有研究表明，PCP 能誘導(dǎo)搖蚊(Chironomusriparius)蛻皮激素受體基因和蛻皮激素應(yīng)答基因E74的表達(dá)[46]。

近期，跳蟲的基因組信息進(jìn)一步完善，從中找到與蛻皮激素緊密相關(guān)的基因(如蛻皮激素受體基因)，研究PCP暴露下這些基因的表達(dá)變化，將能進(jìn)一步闡明PCP對(duì)跳蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。生物體內(nèi)含有多種CYP450和GST，找到跳蟲其他的CYP450和GST基因開展相關(guān)研究，將能進(jìn)一步了解PCP對(duì)跳蟲代謝轉(zhuǎn)化酶的影響。此外，基因表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，而且不同基因的響應(yīng)速度不同，本實(shí)驗(yàn)的暴露時(shí)間為2 d，測(cè)定不同時(shí)間暴露下的基因表達(dá)，將能進(jìn)一步了解PCP對(duì)跳蟲基因表達(dá)的影響。自然土壤和人工土壤的性質(zhì)存在著差異，而土壤性質(zhì)能影響污染物的毒性，本實(shí)驗(yàn)使用的土壤是人工土壤，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)具有代表性的自然土壤開展相關(guān)研究。

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