基于RAPD技術(shù)檢測(cè)不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體對(duì)日本三角渦蟲的遺傳毒性

張合彩，石長(zhǎng)應(yīng)，劉童祎，劉艷方，陳廣文，劉德增

河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007

淡水渦蟲隸屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)、渦蟲綱(Turbellaria)、三腸目(Tricladida)、淡水亞目(Paludicola)，廣泛分布于世界各地潔凈的泉溪湖泊之中，是淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要成員之一。由于渦蟲對(duì)環(huán)境中的毒性因子非常敏感，亞致死劑量的農(nóng)藥、重金屬等都會(huì)引起其從DNA分子到個(gè)體水平的損傷改變[1-4]；此外，淡水渦蟲易于大量采集且室內(nèi)飼養(yǎng)成本相對(duì)較低，所有這些特點(diǎn)使得淡水渦蟲成為毒理學(xué)研究的合適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。日本三角渦蟲(Dugesiajaponica)是東亞地區(qū)廣泛分布的淡水渦蟲物種，由于具有強(qiáng)大的再生能力及高度的化學(xué)敏感性，已逐漸成為再生藥物、干細(xì)胞、神經(jīng)疾病及毒理學(xué)研究的模式生物[5]。

離子液體(Ionic Liquids，ILs)是一類完全由離子構(gòu)成，在室溫或較低溫度(<100 ℃)下呈液態(tài)的鹽，也稱為室溫離子液體或低溫熔融鹽[6]。因其具有不揮發(fā)、不易燃、電導(dǎo)率高、蒸氣壓小、性質(zhì)穩(wěn)定、溶解性好、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)等優(yōu)良特性而在諸多工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但是隨著研究的深入及應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，人們逐漸對(duì)離子液體的綠色性產(chǎn)生質(zhì)疑，對(duì)其生物毒性及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的相關(guān)研究屢見(jiàn)報(bào)道。由N，N -二烷基咪唑陽(yáng)離子與陰離子構(gòu)成的咪唑類離子液體具有易于制備、結(jié)構(gòu)易于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用和研究較多的離子液體[7]。關(guān)于離子液體對(duì)水藻[8]、浮萍[9]、大型蚤[10]、河蚌[11]以及斑馬魚[12]等水生生物的毒性測(cè)試已見(jiàn)諸報(bào)道，其中也有研究表明離子液體生物毒性的大小隨其烴鏈長(zhǎng)度的增加而增強(qiáng)。但是，迄今為止離子液體對(duì)淡水渦蟲的毒性研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

彗星分析及染色體畸變?cè)挥糜跈z測(cè)環(huán)境中有毒物質(zhì)對(duì)渦蟲的遺傳毒性效應(yīng)[1,13]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，在遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域又出現(xiàn)了許多基于PCR技術(shù)的DNA分析方法。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)就是其中之一，該技術(shù)基于PCR，能從DNA 分子水平直接反映整個(gè)基因組的特征，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)基因組DNA因發(fā)生片段的插入、缺失或堿基的突變而產(chǎn)生的多態(tài)性信息[14]。RAPD技術(shù)最早用于遺傳作圖、分類及系統(tǒng)發(fā)育的多態(tài)性檢測(cè)，后來(lái)又被用于遺傳毒性及致癌作用分析[15]。目前，RAPD技術(shù)已成功用于污染物對(duì)動(dòng)物、植物、微生物及體外培養(yǎng)細(xì)胞系的遺傳毒性檢測(cè)[16-20]。本文利用RAPD技術(shù)檢測(cè)4種不同烴鏈長(zhǎng)度的咪唑基離子液體對(duì)日本三角渦蟲的遺傳毒性，旨在考察咪唑基離子液體側(cè)鏈長(zhǎng)度與其遺傳毒性大小的關(guān)系，從而為闡釋離子液體的毒性機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為離子液體環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和科學(xué)管理積累資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 離子液體

實(shí)驗(yàn)用4種咪唑類離子液體溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、溴化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Br)、溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)、溴化1-癸基-3-甲基咪唑([C10mim]Br)均購(gòu)自湖北恒碩化工有限公司(武漢)(圖1)，純度大于99%，其中[C4mim]Br為白色晶體，其余均為淡黃色粘稠液體。實(shí)驗(yàn)前先用雙蒸水分別配成2 000、1 500、1 000和100 mg·L-1的母液，密封保存于4 ℃冰箱內(nèi)，實(shí)驗(yàn)時(shí)再根據(jù)需要稀釋到相應(yīng)濃度待用。

圖1 離子液體溴化1-烷基-3-甲基咪唑結(jié)構(gòu)式示意圖注： R=C4H9: [C4mim]Br; R=C6H13: [C6mim]Br; R=C8H17: [C8mim]Br; R=C10H21: [C10mim]Br。Fig. 1 General structure of alkylmethylimidazolium-based ionic liquids (ILS)Note: R=C4H9: [C4mim]Br; R=C6H13: [C6mim]Br; R=C8H17: [C8mim]Br; R=C10H21: [C10mim]Br.

1.2 供試動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用日本三角渦蟲(D.japonica)采自河南省淇縣魚泉鄉(xiāng)溪流中，用曝氣自來(lái)水飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每2周用新鮮的魚脾臟飼喂一次，喂食后每2天換水一次。饑餓處理一周以上的渦蟲方可用于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3 毒性暴露與取樣

根據(jù)石長(zhǎng)應(yīng)等[21]測(cè)定4種咪唑類離子液體對(duì)渦蟲的半致死濃度(LC50)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)定其1/8LC50(即[C4mim]Br 260 mg·L-1、[C6mim]Br 115 mg·L-1、[C8mim]Br 39 mg·L-1、[C10mim]Br 4 mg·L-1)為本實(shí)驗(yàn)處理濃度。隨機(jī)挑選形態(tài)正常、最大伸展體長(zhǎng)(10±2) mm的渦蟲個(gè)體25條，平均分為5組，每組5條，置于培養(yǎng)皿中。將其中1組設(shè)為對(duì)照組，用曝氣自來(lái)水培養(yǎng)，另外4組設(shè)為處理組，分別用上述濃度的4種離子液體暴露處理。整個(gè)實(shí)驗(yàn)于恒溫培養(yǎng)箱(20±1) ℃中進(jìn)行，每24 小時(shí)更換一次處理液。在暴露處理的第3天和第5天分別從各處理組中隨機(jī)挑取1條渦蟲用于基因組DNA提取。

1.4 基因組DNA提取

渦蟲基因組DNA的提取根據(jù)Zhang和Qiao[22]對(duì)蚜蟲的提取方法稍作改動(dòng)。單條渦蟲加適量STE緩沖液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)勻漿，然后加適量裂解液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，1% SDS，0.5 mg·mL-1proteinase K，pH 8.0)于55 ℃消化2～4 h至澄清，再用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。所得DNA用冷乙醇沉淀，再經(jīng)離心、沖洗、干燥后溶于40 μL TE緩沖液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)中，殘余RNA用RNase A于37 ℃消化除去。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA分子的質(zhì)量(完整性)，用NanoDrop 2000 微量分光光度計(jì)(基因公司)測(cè)定其濃度及純度(OD260/OD280)。

1.5 RAPD-PCR擴(kuò)增

根據(jù)張合彩等[23]優(yōu)化的渦蟲RAPD-PCR條件，對(duì)購(gòu)自上海生工的20條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，篩選出的引物用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為15 μL，含20 ng基因組DNA、0.2 μmol·L-1隨機(jī)引物(上海生工)、2×Taq Master Mix(鄭州森思科貿(mào))。擴(kuò)增反應(yīng)在DNA thermocycler擴(kuò)增儀(Biometra公司，德國(guó))上進(jìn)行，其反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，之后終延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用GIS-1000凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(廣州方統(tǒng)生物科技)拍照，用圖像分析軟件Genescope1.73對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小進(jìn)行自動(dòng)評(píng)估。

1.6 基因組模板穩(wěn)定性計(jì)算

基因組模板穩(wěn)定性(GTS)依據(jù)公式GTS (%) = (1-a/n)×100計(jì)算，此處“a”為處理組的多態(tài)性條帶數(shù)，“n”是對(duì)照組的總帶數(shù)。RAPD圖譜的多態(tài)性包括與對(duì)照組相比的新增帶和消失帶[24]。為便于比較，將對(duì)照組GTS設(shè)為100%，各處理組GTS以相對(duì)對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 基因組DNA及RAPD圖譜的可重復(fù)性

圖2 經(jīng)4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑類離子液體暴露3 d和5 d時(shí)的渦蟲基因組DNA注：0, 對(duì)照組；4C, [C4mim]Br；6C, [C6mim]Br；8C, [C8mim]Br；10C, [C10mim]Br；M, DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上而下分別為10 000、7 000、4 000、2 000、1 000、500、250 bp)。Fig. 2 The quality of DNA isolated from Dugesia japonica exposed to imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 daysNote: 0, Control; 4C, [C4mim]Br; 6C, [C6mim]Br; 8C, [C8mim]Br; 10C, [C10mim]Br; M, DNA molecular size marker (10 000, 7 000, 4 000, 2 000, 1 000, 500, 250 bp from top to bottom).

圖3 引物S10擴(kuò)增的渦蟲RAPD圖譜的可重復(fù)性注： M, DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上而下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。Fig. 3 Reproducibility of RAPD profiles generated from planarian DNA by primer S10Note: M, DNA molecular size marker (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp from top to bottom).

所提基因組DNA的OD260/OD280比值在1.7～2.2之間，說(shuō)明各樣品的純度較高。電泳結(jié)果表明各DNA樣品均為單條帶，說(shuō)明所提DNA分子完整性好，沒(méi)有降解(圖2)。引物S10對(duì)同一樣品的擴(kuò)增結(jié)果表明RAPD-PCR結(jié)果穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的可重復(fù)性(圖3)。

2.2 4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體對(duì)渦蟲RAPD圖譜的影響

在20條隨機(jī)引物中只有11條(表1)能擴(kuò)增出穩(wěn)定且多態(tài)性較高的RAPD條帶，其他9條無(wú)擴(kuò)增或?yàn)閺浬?圖4、表2)。RAPD圖譜的變化主要表現(xiàn)在與對(duì)照相比條帶亮度的增強(qiáng)或減弱以及新帶的出現(xiàn)和正常帶的消失。本研究中經(jīng)4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體暴露的渦蟲RAPD 圖譜與對(duì)照相比明顯不同，且隨著離子液體烴鏈長(zhǎng)度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生明顯改變，其中新增帶(a)、消失帶(b)、亮度增加帶(c)以及亮度減弱帶(d)的總數(shù)在5 d時(shí)4種離子液體組分別為63、66、74、80條(表2)。

總體而言，處理組新增帶的條數(shù)不但與離子液體的碳鏈長(zhǎng)度正相關(guān)而且與暴露的時(shí)間正相關(guān)(圖4、表2)。暴露3 d時(shí)，離子液體處理組渦蟲的新增帶分別為12、16、18和20條。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)各處理組新增帶的條數(shù)增加，至暴露5 d時(shí)4個(gè)處理組的新增帶條數(shù)分別增至17、18、20和22條。

在11條引物的擴(kuò)增圖譜中，離子液體處理組均有正常條帶的消失(圖4、表2)，并且消失帶的條數(shù)也與離子液體的碳鏈長(zhǎng)度及暴露時(shí)間正相關(guān)。暴露3 d時(shí)，離子液體處理組的消失帶條數(shù)分別為14、16、17、19條。當(dāng)暴露至5 d時(shí)，4個(gè)處理組渦蟲RAPD圖譜消失帶的條數(shù)分別增至16、17、19和20條。此外，處理組渦蟲RAPD圖譜中亮度增強(qiáng)帶和減弱帶的總數(shù)一定程度上也隨離子液體碳鏈長(zhǎng)度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，即與之存在正相關(guān)關(guān)系。

2.3 基因組模板穩(wěn)定性(GTS)

基因組模板穩(wěn)定性(GTS)是反應(yīng)處理組PCR擴(kuò)增譜相對(duì)對(duì)照組改變的百分比值。對(duì)每一條引物而言，其擴(kuò)增的多態(tài)性條帶隨離子液體碳鏈長(zhǎng)度(4、6、8、10)和暴露時(shí)間(3 d、5 d)而異(表2)。我們根據(jù)篩選出來(lái)的11條引物擴(kuò)增的RAPD圖譜計(jì)算出了各處理組總的GTS值(圖5)。4種不同烴鏈長(zhǎng)度的咪唑基離子液體處理組渦蟲在暴露3 d和5 d時(shí)的GTS值分別為60%、51%、46%、40%和49%、46%、40%、35%，即對(duì)于同樣暴露時(shí)間隨著離子液體碳鏈長(zhǎng)度的增加各處理組渦蟲基因組模板穩(wěn)定性下降；而對(duì)于同一種離子液體，則隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)其GTS值降低。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this experiment

表2 4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體處理3 d和5 d時(shí)渦蟲的RAPD圖譜多態(tài)性帶及變異帶Table 2 Polymorphic bands and varied bands in Dugesia japonica treated by 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain length for 3 and 5 days

注：a, 新增帶;b, 消失帶;c, 亮度增強(qiáng)帶;d, 亮度減弱帶；a+b, 多態(tài)性帶;a+b+c+d, 變異帶。

Note：a, appearance of new bands;b, disappearance of normal bands;c, increase in band intensities;d, decrease in band intensities;a+b, polymorphic bands;a+b+c+d, varied bands.

圖4 引物S15、S20、S80及S84擴(kuò)增的4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體暴露3 d和5 d的渦蟲RAPD圖譜注：0, 對(duì)照；4C, [C4mim]Br；6C, [C6mim]Br；8C, [C8mim]Br；10C, [C10mim]Br；M, DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上而下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。Fig. 4 RAPD profiles of D. japonica exposed to 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 days with primers S15, S20, S80 and S84Note: 0, Control; 4C, [C4mim]Br; 6C, [C6mim]Br; 8C, [C8mim]Br; 10C, [C10mim]Br; M, DNA molecular size marker (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp from top to bottom).

圖5 渦蟲經(jīng)4種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體暴露3 d和5 d的基因組模板穩(wěn)定性Fig. 5 Genomic DNA template stability (GTS) of D. japonica exposed to 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 days

3 討論(Discussion)

RAPD技術(shù)在出現(xiàn)伊始常常被用于遺傳作圖、分類及系統(tǒng)發(fā)育研究，后來(lái)該技術(shù)在檢測(cè)DNA突變等方面也有應(yīng)用。由于該技術(shù)具有快速、無(wú)放射性，適于檢測(cè)任何生物的DNA損傷以及突變和重排等優(yōu)點(diǎn)，目前已在多種生物中用于檢測(cè)不同類型污染物的遺傳毒性[16-20]。

本研究利用RAPD技術(shù)檢測(cè)了4種不同烴鏈長(zhǎng)度的咪唑基離子液體對(duì)日本三角渦蟲的遺傳毒性，結(jié)果表明離子液體處理組渦蟲的RAPD圖譜和對(duì)照組明顯不同，主要表現(xiàn)在條帶亮度的變化以及正常帶的消失和新增帶的出現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道生物體在離子液體脅迫下其體內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會(huì)增加[25-26]。生物體內(nèi)由ROS引起的DNA損傷包括鏈斷裂、堿基改變以及無(wú)堿基位點(diǎn)[27]。除了ROS攻擊，由于DNA加合物的不完全剪切修復(fù)，DNA鏈的斷裂和錯(cuò)配也常常發(fā)生。處理組引物結(jié)合位點(diǎn)DNA的損傷或突變將會(huì)導(dǎo)致與無(wú)損傷對(duì)照相比DNA指紋的變化。本研究中RAPD圖譜的變化包括條帶亮度的變化以及正常帶的消失和新增帶的出現(xiàn)。正常條帶的消失可能與基因毒性劑誘導(dǎo)的DNA損傷、點(diǎn)突變以及染色體重排等事件有關(guān)[28]。處理組RAPD圖譜中也檢測(cè)到了新PCR產(chǎn)物(新條帶)的出現(xiàn)。新擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)可能是由于突變、大的缺失以及同源重組引起的引物結(jié)合位點(diǎn)的改變[24]。關(guān)于條帶亮度的改變，離子液體誘導(dǎo)的氧化性DNA損傷以及DNA—蛋白交聯(lián)會(huì)阻礙Taq聚合酶的進(jìn)程從而使某些特定RAPD條帶亮度減弱，而由于DNA改變?cè)黾恿艘锱cDNA模板的配對(duì)活性則會(huì)使某些條帶亮度增強(qiáng)[29]。

本研究中，對(duì)于同一種離子液體隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)其RAPD圖譜的多態(tài)性增加，即存在時(shí)間依賴性關(guān)系，這和利用RAPD技術(shù)檢測(cè)藥物8-羥基喹啉對(duì)泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)以及呋喃西林對(duì)游仆蟲(Euplotesvannus)的遺傳毒性所得結(jié)果一致[16,30]。此外，在同一暴露時(shí)間隨著離子液體碳鏈長(zhǎng)度的增加渦蟲RAPD圖譜的多態(tài)性也增加，這說(shuō)明隨著咪唑基離子液體碳鏈長(zhǎng)度的增加，其對(duì)渦蟲DNA的損傷，即遺傳毒性增強(qiáng)。這和我們以前關(guān)于不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑基離子液體對(duì)渦蟲的急性毒性及攝食、再生的影響的研究結(jié)果相一致[21,31]。Aksakal和Esim[17]的研究已經(jīng)證實(shí)基因組模板穩(wěn)定性(GTS)是反應(yīng)污染物誘導(dǎo)的RAPD圖譜改變的一個(gè)靈敏參數(shù)。本研究中各處理組的GTS值隨不同種離子液體的碳鏈長(zhǎng)度增加及同種離子液體暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這說(shuō)明離子液體脅迫明顯影響了渦蟲的基因組模板穩(wěn)定性。

總之，本研究表明咪唑基離子液體對(duì)淡水渦蟲有明顯的遺傳毒性，且該遺傳毒性的強(qiáng)弱與離子液體側(cè)鏈碳原子數(shù)正相關(guān)。同時(shí)，我們的研究結(jié)果也證明RAPD分析是一種檢測(cè)環(huán)境污染物對(duì)生物DNA損傷的高度靈敏的方法。

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