張麗宏+傅云+廖建

[摘要] 目的 研究甘草苷對中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）光老化的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法 用不同濃度的甘草苷作用于HaCaT細(xì)胞，噻唑藍(lán)比色（MTT）法篩選甘草苷的安全有效濃度；用30 mJ/cm2的UVB照射HaCaT細(xì)胞，建立光老化模型。用10-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷處理甘草苷+UVB組細(xì)胞24 h，MTT法檢測甘草苷對光老化HaCaT細(xì)胞增殖率的影響；試劑盒檢測HaCaT細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量；蛋白免疫印記法檢測HaCaT細(xì)胞中白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷對HaCaT細(xì)胞無明顯的促增殖與抑制作用（P > 0.05），為最佳安全有效濃度。與空白組相比，UVB組細(xì)胞增殖率顯著降低，GSH、CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著升高（P < 0.01）。與UVB組相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB組細(xì)胞增殖率顯著升高，GSH、CAT活性明顯上升，MDA含量顯著降低，IL-1β 、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 甘草苷對UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光老化有保護(hù)作用，其機(jī)制與其提高抗氧化酶活性，抑制炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 甘草苷；中波紫外線；光老化；人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effects and the mechanism of liquiritin on photoaging human keratinocytes （HaCaT） cells induced by ultraviolet B （UVB）. Methods The different concentrations of liquiritin were used on HaCaT cells， the best effective and safe concentration of liquiritin was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）. The photoaging model was set up by the irradiation of UVB at irradiation dose of 30 mJ/cm2. It was used to treat liquiritin + UVB group cells 24 h with 10-7， 10-6， 10-5 mol/L， the effects of liquiritin on the proliferation rate of photoaging model HaCaT cells were detect by MTT. The activity of glutathione （GSH）， catalase （CAT） and the content of malondialdehyde （MDA） were detected by the corresponding kits. The detection of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） protein expression were detected by Western blot. Results The liquiritin with the concentrations of 10-7， 10-6， 10-5 mol/L had no obvious effect on the proliferation and inhibition of HaCaT cells （P > 0.05）， which were the best safe and effective concentrations. Compared with the blank group， the cell proliferation rate of the UVB group was significantly decreased， the activity of GSH and CAT was significantly decreased， and the content of MDA was significantly increased， the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α protein were increased （P < 0.01）. Compared with the UVB group， the cell proliferation rates of the （10-7， 10-6， 10-5） mol/L liquiritin+UVB group were significantly increased， the activity of GSH and CAT was significantly increased， the content of MDA was significantly decreased， the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α protein were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Liquiritin can protect HaCaT cells photoaging， which mechanism is related to the improvement of antioxidant enzyme activity and inhibition of inflammatory cytokines.endprint

[Key words] Liquiritin； Ultraviolet B； Photoaging； Human keratinocytes

皮膚光老化是指紫外線（UV）輻射造成皮膚干燥、粗糙、彈性缺失，皺紋增多和色素沉著，甚至誘導(dǎo)癌性病變等[1]。長期的UV輻射可破壞皮膚的屏障功能，減弱皮膚對外界刺激的抵抗力[2]。近年來，工業(yè)化的生產(chǎn)日益增加，環(huán)境的污染日益加重，臭氧層阻擋UV的能力減弱，輻射至地球表面的UV逐漸增多，由此導(dǎo)致皮膚光老化現(xiàn)象普遍增多[3]。隨著人們對美容的重視，UV輻射造成的皮膚光老化越來越引起人們關(guān)注，探索中藥預(yù)防及治療皮膚光老化已成當(dāng)今重點(diǎn)。

甘草，為豆科甘草屬植物的根和根莖，甘草苷是甘草根部提取出的一種重要活性成分之一，現(xiàn)代研究表明，甘草苷具有抗氧化、抗過敏、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抑菌、抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[4]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5]，當(dāng)UVB照射劑量為30 mJ/cm2時，即可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞光損傷，并且發(fā)生凋亡和壞死。因此，本實(shí)驗(yàn)采用30 mJ/cm2中波紫外線（UVB）輻射人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），制備光老化模型，用不同濃度甘草苷作用于光老化HaCaT細(xì)胞，研究甘草苷對光老化HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制，為預(yù)防和治療皮膚光老化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT（中喬新舟），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20170516）；谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20170619）；過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20170526）；兔抗人β-actin單克隆抗體（博奧森生物有限公司）；兔抗人白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）多克隆抗體（博奧森生物有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-16082811）。miniPROTEANTetra Cell電泳儀，BIO-RAD公司；Trans-Blot SD Cell半干轉(zhuǎn)膜儀，BIO-RAD公司；Smart chemi Ⅱ型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司。

1.2 藥物的配制

根據(jù)公式C=n/v，精密稱取甘草苷8.37 mg，用10 μL DMSO溶解后，再加入20 mL DMEM培養(yǎng)液混勻，配制成濃度為10-3 mol/L的藥物母液，將母液依次稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 mol/L的濃度，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。

1.3 噻唑藍(lán)比色（MTT）法篩選甘草苷安全有效濃度

細(xì)胞生長至對數(shù)期，以1×104個/孔將細(xì)胞接種至96孔板，200 μL/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為空白組和甘草苷組。吸棄培養(yǎng)液，空白組加入200 μL培養(yǎng)液；甘草苷組加入200 μL不同濃度（10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L）甘草苷藥液。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），150 μL/孔，于37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長處測定吸光度值（OD）。細(xì)胞增殖率（%）=OD492給藥組/OD492空白組×100%。

1.4 MTT法檢測甘草苷對光老化HaCaT細(xì)胞增殖率的影響

96孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為空白組、UVB組、（10-7、10-6、10-5 mol/L）甘草苷+UVB組。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加200 μL PBS，空白組使用鋁箔紙覆蓋，用30 mJ/cm2 UVB照射UVB組和甘草苷+UVB組，照射完畢，吸棄PBS，UVB組加入200 μL培養(yǎng)液，甘草苷+UVB組分別加入200 μL 10-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷藥液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL MTT，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO，150 μL/孔，37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長處測定OD。

1.5 微板法、可見光法、TBA法檢測HaCaT細(xì)胞中GSH、CAT活性和MDA含量

細(xì)胞生長至對數(shù)期，以1×106個/孔將細(xì)胞接種至6孔板，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6孔板細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為空白組、UVB組、（10-7、10-6、10-5 mol/L）甘草苷+UVB組。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加1 mL PBS，空白組使用鋁箔紙覆蓋，用30 mJ/cm2 UVB照射UVB組和甘草苷+UVB組，照射完畢，吸棄PBS，UVB組加2 mL培養(yǎng)液，甘草苷+UVB組分別加入2 mL的0-7、10-6、10-5 mol/L的甘草苷藥液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時，收集6孔板中各組細(xì)胞，PBS洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF以99∶1混勻，按照100 μL/孔加入混合液，冰盒上靜置30 min，4℃，13 200 r/min的條件下離心15 min，在冰盒上收集上清液于離心管中，按照試劑盒說明書分別用微板法、可見光法、TBA法檢測各組細(xì)胞中GSH、CAT活性和MDA含量。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量

參照“1.5”培養(yǎng)6孔板細(xì)胞。待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時，收集6孔板中細(xì)胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度，上樣緩沖液和蛋白樣品以1∶4的比例混勻，煮沸10 min。根據(jù)蛋白濃度計算上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min，半干轉(zhuǎn)膜30 min，室溫封閉2 h，加入一抗孵育，4℃過夜，TBST洗膜3次，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯色，使用發(fā)光成像儀拍攝，利用Lane ID凝膠軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值，反映目的蛋白的表達(dá)水平。endprint

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草苷安全有效濃度

與空白組相比，10-10、10-9 、10-8 mol/L甘草苷可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P < 0.01）；10-4、10-3 mol/L甘草苷可明顯抑制細(xì)胞增殖（P < 0.01）；10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計意義（P > 0.05），對細(xì)胞無明顯的促增殖與抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見表1。

2.2 甘草苷對光老化HaCaT細(xì)胞增殖率的影響

與空白組相比，UVB組細(xì)胞增殖率顯著降低（P < 0.01）；與UVB組相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB組細(xì)胞增殖率顯著升高（P < 0.01）。見表2。

2.3 HaCaT細(xì)胞中GSH、CAT活性和MDA含量

與空白組相比，UVB組GSH、CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P < 0.01）；與UVB組相比，甘草苷+UVB組GSH、CAT活性明顯上升，MDA含量顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.4 HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量

與空白組相比，UVB組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著升高（P < 0.01）；與UVB組相比，10-7、10-6、10-5 mol/L甘草苷+UVB組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表4、圖1。

3 討論

人體皮膚長期暴露于紫外線下，可引起表皮微環(huán)境的改變，主要表現(xiàn)在眾多細(xì)胞因子的釋放[6]。角質(zhì)細(xì)胞占據(jù)人皮膚表皮細(xì)胞的90%[7]，具有分泌細(xì)胞因子的功能，可通過釋放細(xì)胞因子間接地影響機(jī)體的免疫功能[8]。UV輻射引起的氧化應(yīng)激可促使體內(nèi)產(chǎn)生大量的過氧化物[9]，當(dāng)堆積于體內(nèi)的過氧化物超過機(jī)體正常清除自由基的能力時，將會對機(jī)體造成破壞性的反應(yīng)[10]，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)達(dá)不到動態(tài)平衡，從而使組織器官的機(jī)能逐步退化，機(jī)體表現(xiàn)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象[11]。UV作用于HaCaT細(xì)胞，可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致多種炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α等的產(chǎn)生[12]。機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時，TNF-α是出現(xiàn)最早的起關(guān)鍵作用的炎性因子，它能刺激淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，并誘導(dǎo)其他炎性因子的合成和釋放[13]。IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行宿主防御功能的炎性因子[14]，它可與與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄信號級聯(lián)系統(tǒng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子的產(chǎn)生[15]。此外，IL-1β可通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和激活蛋白AP-1，誘導(dǎo)皮膚炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MMP-1的產(chǎn)生[16]，誘導(dǎo)皮膚光老化，此過程又可經(jīng)過逆向調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)，引發(fā)炎性反應(yīng)和組織損傷[17]。IL -6是炎性反應(yīng)過程中的重要促發(fā)劑，可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，刺激B細(xì)胞分化合產(chǎn)生抗體，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[18]。IL-6還可通過自分泌機(jī)制促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達(dá)，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，誘導(dǎo)皮膚光老化[19]。陶冶等[20]實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，UVB照射可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌炎性因子IL-1β和IL-6，間接導(dǎo)致皮膚光老化。UV輻射引發(fā)的TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的聚集，不僅可以導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)、組織水腫及通透性增加等[21]，還可通過正反饋?zhàn)饔么偈筃F-κB效應(yīng)進(jìn)一步放大，增強(qiáng)UV輻射效應(yīng)，形成一個惡性循環(huán)[22]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，UVB作用于細(xì)胞后，GSH、CAT活性顯著降低，MDA含量顯著增加，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著升高，說明UVB可降低機(jī)體內(nèi)氧化酶活性，促使炎性因子的分泌，從而造成氧化損傷。而加入甘草苷藥物干預(yù)后，GSH、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量顯著降低，提示甘草苷可以升高氧化酶活性，減少炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步減輕UVB對細(xì)胞造成的氧化損傷，抑制皮膚光老化。

綜上所述，甘草苷可通過提高抗氧化酶活性和抑制炎性因子的產(chǎn)生，減輕氧化損傷，從而抵抗UVB對人皮膚造成的光損傷。但甘草苷是否能通過其他方式抑制人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞光老化，有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李建民，楊柳，王業(yè)秋，等.補(bǔ)骨脂素對中波紫外線導(dǎo)致人皮膚HaCaT細(xì)胞光老化的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，17（2）：214-219，294.

[2] 張宇，曹南開，張小卿，等.桃紅四物湯對光老化小鼠皮膚組織中MMP-1、MMP-3 mRNA及血清中TNF-α、IL-1含量表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，4（4）：919-921.

[3] 王兵，王亞新，趙紅燕，等.甘草的主要成分及其藥理作用的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2013，34（3）：215-218.

[4] 馮月.甘草酸和甘草苷提取工藝及抗氧化活性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[5] 周玉杰，李瑞欣，孫凱，等.五味子乙素對UVA損傷組織工程皮膚保護(hù)作用的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2014，23（6）：457-461.

[6] Eunson Hwang，Sang-Yong Park，Chang Shik Yin，et al. Antiaging effects of the mixture of Panax ginseng and Crataegus pinnatifida in human dermal fibroblasts and healthy human skin [J]. J Ginseng Res，2017，41（1）：69-77.endprint

[7] Wu D，Yuan P，Ke C，et al. Salidroside suppresses solar ultraviolet-induced skin inflammation by targeting cyclooxygenase-2 [J]. Oncotarget，2016，7（18）：25 971-25 982.

[8] 王鑫麗，涂穎，何黎，等.燈盞花素局部外用對紫外線致Balb/c小鼠皮膚光老化的保護(hù)作用[J].皮膚病與性病，2016，38（2）：88-90.

[9] Hwang E，Sun ZW，Lee TH，et al. Enzyme-processed Korean Red Ginseng extracts protects against skin damage induced by UVB irradiation in hairless mice [J]. J Ginseng Res，2013，37（4）：425-434.

[10] Lee Y，Kim H，Kim S，et al. Myeloid differentiation factor 88 regulates basal and UV-induced expressions of IL-6 and MMP-1 in human epidermal keratinocytes [J]. J Invest Dermatol，2009，129（2）：460-467.

[11] 楊林芳.新化合物ECPIRM及ATRA對角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥因子的影響和相關(guān)機(jī)制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2015.

[12] 馬月丹.絞股藍(lán)總皂苷干預(yù)光老化HaCaT細(xì)胞對HSF細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[13] 陶冶，張小卿，吳景東.絞股藍(lán)總皂苷含藥血清對皮膚光老化HaCaT細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6的影響[J].河南中醫(yī)，2013，33（1）：48-50.

[14] 李紅光.枸杞多糖在UVB輻射人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷中的保護(hù)作用[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[15] Xue P，Wang Y，Zeng F，et al. Paeonol suppresses solar ultraviolet-induced skin inflammation by targeting T-LAK cell-originated protein kinase [J]. Oncotarget，2017， 8（16）：27 093-27 104.

[16] 楊柳，王業(yè)秋，張寧，等.黃芩素對UVB導(dǎo)致人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞光老化的保護(hù)作用[J].中醫(yī)藥信息，2017， 34（4）：18-21.

[17] 馬月丹，張燚，王繼慧，等.絞股藍(lán)總皂苷干預(yù)光老化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥分泌因子的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（6）：1273-1275.

[18] 張榮利. Toll受體在UVB誘導(dǎo)NF-κB激活中的作用及其在光線相關(guān)性皮膚病中意義的初步觀察[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

[19] 陳巧云，王業(yè)秋，祁永華，等. UVB誘導(dǎo)HaCaT分泌細(xì)胞因子對HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護(hù)作用[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2016，18（8）：974-976，989.

[20] 陶冶.絞股藍(lán)總皂苷含藥血清對光老化人皮膚角質(zhì)細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[21] 馬東東. SchB對UVA損傷HaCat細(xì)胞和鼠皮膚的保護(hù)作用的研究[D].唐山：河北聯(lián)合大學(xué)，2014.

[22] 郭曉瑞，李紅文，鄭乃剛，等.槲皮素下調(diào)人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)NF-κB和IL-6表達(dá)的表觀遺傳學(xué)修飾效應(yīng)[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2013，27（10）：977-981.

（收稿日期：2017-09-25 本文編輯：李岳澤）endprint