葡萄球菌生物膜形成影響因素的研究進(jìn)展

陳雅+葉聯(lián)華+黃云超

[摘要] 細(xì)菌感染已成為臨床中不能完全避免的情況，包括致病菌和條件致病菌。細(xì)菌生物膜成為細(xì)菌的有效保護(hù)途徑，增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)抗機(jī)體的免疫防御作用及對(duì)抗生素的抵抗性。葡萄球菌生物膜形成受多因素及多基因調(diào)控，外部環(huán)境因素主要是機(jī)體免疫反應(yīng)及外界有機(jī)物，內(nèi)部基因調(diào)控主要是sarA、agr、aap、ica。本文就葡萄球菌生物膜的形成及影響生物膜形成的外部環(huán)境因素和內(nèi)部基因調(diào)控因素進(jìn)行綜述，為葡萄球菌生物膜的靶向藥物研究與治療提供參考。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)菌生物膜；基因調(diào)控；sarA蛋白；agr基因；ica操縱子

[中圖分類號(hào)] R378 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（c）-0037-06

[Abstract] Bacterial infection has become a clinical situation that can't completely avoid， including pathogens and conditioned pathogens. Bacterial biofilm becomes an effective way to protect bacteria， increases the bacteria against the body immune defense and the resistance to antibiotics. Staphylococcus biofilm formation affected by multiple factors and multi-gene regulation， including the external environmental factors， such as organism immune response and external organic matter， the internal genes regulation are mainly sarA， agr， aap， ica. This paper summarizes the formation of Staphylococcal biofilm， the external environmental factors and internal gene regulation factors that affecting biofilm formation， which can be used as a reference for the study and treatment of Staphylococcal biofilm targeted drugs.

[Key words] Bacteria biofilm； Gene regulation； SarA protein； Agr gene； Ica operon

致病細(xì)菌一旦通過(guò)人類呼吸道、傷口進(jìn)入人體將會(huì)導(dǎo)致感染，引起一系列臨床癥狀。據(jù)調(diào)查顯示，有超過(guò)80%的人類傷口慢性感染是與生物膜相關(guān)的，這種感染最常見(jiàn)于表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸桿菌，如大腸埃希菌[1]。當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體后，可以附著在生物和非生物表面，并形成由黏多糖、蛋白質(zhì)等組成的生物膜，生物膜一旦形成，細(xì)菌可適應(yīng)機(jī)體微環(huán)境，引發(fā)耐藥性和炎癥，并導(dǎo)致持續(xù)性感染。

近年來(lái)，關(guān)于細(xì)菌生物膜形成機(jī)制、相關(guān)基因調(diào)控、導(dǎo)致持續(xù)性感染、抑制生物膜形成相關(guān)因素等方面的研究迅速發(fā)展。本文就關(guān)于葡萄球菌生物膜形成及其影響因素進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌生物膜定義及形成

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌嵌入自身所產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)后所形成的一個(gè)多細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)[2]，并且在生長(zhǎng)速度和基因轉(zhuǎn)錄方面表現(xiàn)出特定的表型。生物膜包括三個(gè)基本成分：細(xì)菌本身、基質(zhì)以及表面液體或液體-空氣界面。生物膜基質(zhì)由細(xì)菌產(chǎn)生，其主要成分由水和細(xì)胞外聚合物（也稱多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物或者黏液層）組成。生物膜基質(zhì)為黏附群體提供了建筑結(jié)構(gòu)和保護(hù)，賦予了自由浮動(dòng)的細(xì)菌不可能完成的生理和代謝能力[3-4]。

金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌同屬于葡萄球菌，前者能產(chǎn)生凝固酶，是致病菌，后者是條件致病菌，但是它們生物膜的形成過(guò)程是相似的。其生物膜形成主要包括4個(gè)步驟：黏附、聚集、成熟、播散。①黏附：生物膜形成的初始步驟是細(xì)菌對(duì)異物或者生物材料表面的黏附。細(xì)菌在黏附前的表面調(diào)節(jié)是生物膜形成的重要前提。如：生物材料植入血液中時(shí)，材料的表面被血液中的白蛋白、補(bǔ)體因子、黏蛋白等吸附，并且快速修飾，這種調(diào)節(jié)永久地改變了生物材料的表面，并且能夠促進(jìn)細(xì)菌的黏附[3]。而細(xì)菌自身產(chǎn)生的特異性蛋白也能介導(dǎo)其本身與非生物表面的結(jié)合，如葡萄球菌中的自溶蛋白（autocytolysin，AltE）。②聚集：細(xì)菌不可逆地附著在生物或非生物表面便開(kāi)始形成非常獨(dú)特的微生物聚集體，稱為微菌落[5]。每個(gè)細(xì)菌都能產(chǎn)生自誘導(dǎo)物，細(xì)菌達(dá)到一定的密度，其周圍環(huán)境信號(hào)分子累積，當(dāng)達(dá)到閾水平時(shí)，細(xì)菌之間就能“交流”，最終使整個(gè)群體可以做出協(xié)調(diào)的反應(yīng)，這就是群體感應(yīng)。群體感應(yīng)可以修改細(xì)菌群體行為，使其整體執(zhí)行相應(yīng)的功能。③成熟：隨著細(xì)菌聚集、增殖以及細(xì)菌間群體感應(yīng)的整體調(diào)節(jié)，生物膜的密度及其復(fù)雜性迅速增加，多層次的細(xì)菌形成，包埋在生物膜中的細(xì)菌會(huì)分泌許多生物膜“支架”，如蛋白質(zhì)、DNA、多糖等，而且細(xì)胞外聚合物大量產(chǎn)生，這就形成了一個(gè)復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外聚合物形成的封閉三維空間散布著開(kāi)放的通道，便于將必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣輸送到生物膜內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞中[3-6]。④播散：當(dāng)生物膜達(dá)到一定的臨界質(zhì)量，在已形成的穩(wěn)定生物膜的最外層的細(xì)菌可以通過(guò)解吸、脫離和分散，從生物膜釋放并附著于其他生物或非生物表面。這一過(guò)程與群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)[7-8]。endprint

以上4個(gè)步驟是生物膜形成的過(guò)程，在實(shí)際中是不斷循環(huán)的。黏附是一處表面生物膜形成的開(kāi)始，而播散卻又為另一處表面生物膜形成的開(kāi)始提供必須的材料。當(dāng)然，細(xì)菌生物膜的形成受許多因素影響，包括機(jī)體內(nèi)外因素及細(xì)菌自身的基因調(diào)控。

2 環(huán)境因素對(duì)細(xì)菌生物膜的影響

生物膜的發(fā)育與成熟取決于許多環(huán)境的信號(hào)，這些信號(hào)包括生物因素、化學(xué)因素和物理因素，如宿主本身反應(yīng)、環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分、PH、溫度等。然而許多研究表明，宿主體內(nèi)外許多因素會(huì)影響生物膜的形成與定植，這些因素包括：宿主細(xì)胞、類固醇（如：黃體酮、雌激素、脫氫表雄酮等）[9]、乙醇、疏水蛋白等。

機(jī)體細(xì)胞對(duì)生物膜形成的影響

2.1 機(jī)體細(xì)胞對(duì)生物膜形成的影響

2.1.1 多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear leukocytes，PMNs） 葡萄球菌一旦感染宿主，宿主先天免疫應(yīng)答會(huì)本能地與之對(duì)抗。先天免疫應(yīng)答對(duì)葡萄球菌的影響是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。在先天免疫系統(tǒng)中，PMNs和巨噬細(xì)胞對(duì)葡萄球菌感染最先做出應(yīng)答反應(yīng)，人類的PMNs能定位于葡萄球菌生物膜，從初級(jí)和次級(jí)顆粒中釋放顆粒組分，并吞噬生物膜細(xì)菌，抵抗細(xì)菌生物膜的形成[10]。

一般來(lái)說(shuō)，對(duì)葡萄球菌生物膜相關(guān)感染的宿主免疫應(yīng)答不能完全清除感染。在生物膜存在的情況下，生物膜中的細(xì)菌會(huì)刺激人嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其黏附和吞噬作用顯著增強(qiáng)，而表皮葡萄球菌生物膜胞外多糖及胞間多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）在降低人嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬能力方面起著重要作用，這是由于表皮葡萄球菌PIA陽(yáng)性生物膜能促使C3a釋放，C3b和IgG在表皮葡萄球菌生物膜表面沉積減少，從而有助于表皮葡萄球菌逃避PMNs所介導(dǎo)的殺傷作用。因此生物膜相關(guān)感染會(huì)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥綶11-12]。故如何抑制表皮葡萄球菌逃避先天免疫應(yīng)答將會(huì)有重要的研究?jī)r(jià)值。

2.1.2 成骨細(xì)胞 成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。在骨重建形成骨吸收陷窩中，成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨。而在骨科植入材料中出現(xiàn)葡萄球菌生物膜感染情況下，不僅中性粒細(xì)胞會(huì)參與免疫反應(yīng)，而且成骨細(xì)胞同樣也會(huì)產(chǎn)生一定作用。成骨細(xì)胞能對(duì)細(xì)菌細(xì)胞外聚合物的成分作出反應(yīng)，如細(xì)菌熱休克蛋白GroEL能使細(xì)胞表面的相關(guān)標(biāo)記活化和氧自由基生成增加，該反應(yīng)主要是成骨細(xì)胞通過(guò)增加的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)應(yīng)答，反過(guò)來(lái)可以吸引免疫感受態(tài)細(xì)胞，從而可能引發(fā)或延續(xù)對(duì)生物膜感染的防御[13]。

有研究報(bào)道，在被金黃色葡萄球菌感染的骨髓炎中，成骨細(xì)胞在細(xì)菌感染下能產(chǎn)生白介素-6，白介素-6是細(xì)菌感染中重要的免疫因子，它能增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。不僅如此，白介素-6還能增強(qiáng)CD4+、CD25+T細(xì)胞活性的調(diào)控，促進(jìn)免疫應(yīng)答的發(fā)展進(jìn)程[14]。因此成骨細(xì)胞可能在對(duì)生物膜感染的防御機(jī)制方面有極為重要的研究前景。

2.2 類固醇激素對(duì)生物膜形成的影響

類固醇激素又稱甾體激素，包括孕激素、雌激素等。在對(duì)金黃色葡萄球菌的研究中發(fā)現(xiàn)，類固醇激素能抑制葡萄球菌對(duì)氨基酸的攝取，如：孕激素的量超過(guò)一定值（約15 μg/mL）可以抑制氨基酸攝取，這可能是因?yàn)轭惞檀伎梢宰饔糜诩?xì)胞膜中的特異性攝取系統(tǒng)，延緩葡萄球菌的生長(zhǎng)，而不大量滲透到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，在某種程度上影響細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜的細(xì)胞外因子[15]。

佩爾澤等[16]研究表明，①卵巢類固醇激素（雌二醇和孕酮）能夠調(diào)節(jié)一些微生物物種的體外生長(zhǎng)；②濾泡液支持微生物的長(zhǎng)期存活。雌二醇是女性卵巢分泌的類固醇激素，是主要的雌激素，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)女性特征、附屬性器官的成熟和月經(jīng)—排卵周期，促進(jìn)乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)的產(chǎn)生。而在雌二醇與表皮葡萄球菌的研究中，當(dāng)雌二醇濃度≥125 pmol/L時(shí)形成的生物膜明顯增厚，在細(xì)菌培養(yǎng)的4、6 h階段雖對(duì)細(xì)菌增殖有一定的抑制作用，但是在培養(yǎng)的12 h階段卻又有促進(jìn)作用，在24 h達(dá)到最厚；當(dāng)雌二醇濃度較低（≤50 pmol/L）時(shí)，細(xì)菌形成生物膜厚度比高濃度組和空白組均薄。這表明雌二醇對(duì)生物膜形成有一定的抑制作用，但是存在劑量依賴關(guān)系，只有在低濃度情況下才能發(fā)揮其抑制生物膜形成的作用[17]。雌二醇對(duì)葡萄球菌生物膜形成的影響可為乳腺假體等生物材料植入感染的研究提供新方向。

2.3 外界有機(jī)物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響

2.3.1 乙醇 目前醫(yī)療中乙醇或者含有乙醇的溶劑是應(yīng)用最廣泛的消毒劑。盡管乙醇被認(rèn)為是有效的殺菌物質(zhì)，但是在使用乙醇?xì)⒕笏鶜埓娴纳僭S細(xì)菌仍可繼續(xù)存活和繁殖。殊不知，乙醇若未能完全殺滅葡萄球菌則就能夠有效促進(jìn)葡萄球菌生物膜的形成。葡萄球菌在乙醇環(huán)境中的應(yīng)激能誘導(dǎo)其PIA的合成以及不依賴于rsbU的生物膜形成，如金黃色葡萄球菌在乙醇環(huán)境下通過(guò)取代rsbU從而激活σB或者通過(guò)σB的獨(dú)立途徑激活PIA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)生物膜形成，這是由于乙醇可以上調(diào)ica的表達(dá)，促進(jìn)生物膜的形成[18-19]。

2.3.2 疏水蛋白 眾所周知，疏水蛋白可以將蛋白質(zhì)固定在物質(zhì)表面，從而為常規(guī)物質(zhì)常規(guī)表面改性提供了非共價(jià)選擇。而疏水蛋白涂層表面卻可以有效防止葡萄球菌生物膜形成。在表皮葡萄球菌中，疏水蛋白涂層不是通過(guò)降低參與非生物表面的細(xì)菌蛋白的親和力來(lái)抑制表皮葡萄球菌生物膜形成，其抗生物膜效應(yīng)主要是在生物膜形成的早期階段，可能與生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞外DNA（eDNA）相互作用密切相關(guān)。eDNA在表皮葡萄球菌初始黏附階段起著關(guān)鍵性的作用。而在金黃色葡萄球菌中，雖然eDNA對(duì)初次附著沒(méi)有任何影響，但是在從附著階段到聚集階段的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起關(guān)鍵作用[20]。疏水蛋白涂層與細(xì)菌eDNA的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可為防止生物材料植入后葡萄球菌感染提供重要研究?jī)r(jià)值。

3 基因調(diào)控表達(dá)與細(xì)菌生物膜形成的關(guān)系endprint

葡萄球菌生物膜的形成與許多相關(guān)基因調(diào)控表達(dá)密切相關(guān)，如：sarA（staphylococcal accessory regulator A）、agr（accessory gene regulator，agr）、aap（accumulation-associated protein）、ica等，各類基因調(diào)節(jié)表達(dá)在生物膜不同階段發(fā)揮特異性功能并影響著生物膜的形成。

3.1 sarA對(duì)生物膜形成的影響

3.1.1 sarA的結(jié)構(gòu)功能 在葡萄球菌的研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌中存在一類sar蛋白家族，該家族中存在的蛋白包括：括sarA、sarR、sarS、sarU、sarX、sarV、Rot、mgrA等，它們相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[21]。該家族中sarA是一種14.5 kD，含有124個(gè)氨基酸殘基的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，可以直接或者間接調(diào)控超過(guò)120個(gè)基因（包括agr下游靶基因的轉(zhuǎn)錄），控制細(xì)菌細(xì)胞中許多與毒性相關(guān)的基因表達(dá)，能直接調(diào)控多種毒力因子的產(chǎn)生[22]。

sarA有3個(gè)明顯的啟動(dòng)子——P1、P2和P3，其中P1是最主要的啟動(dòng)子。當(dāng)與sarA同源的sarR與P1結(jié)合，同時(shí)sarB與P3結(jié)合時(shí)能抑制sarA的表達(dá)，使細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)分布改變，減少細(xì)菌與纖連蛋白原結(jié)合，還能影響agr中RNAⅡ和RNAⅢ的表達(dá)水平。sarA還能與其上游一段富含AT的序列結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄水平控制ica、altE等基因的表達(dá)。atlE是一種115kDa的蛋白質(zhì)，屬于一種在細(xì)菌細(xì)胞壁降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)菌肽聚糖水解酶，它能在細(xì)胞壁中起運(yùn)輸流通作用，還參與促使表皮葡萄球菌黏附于塑料表面的能力[23]。

3.1.2 sarA與生物膜形成的關(guān)系 sarA的表達(dá)可促進(jìn)葡萄球菌生物膜的形成，而當(dāng)sarA被抑制時(shí)則抑制了生物膜的形成，這主要是由于sarA的表達(dá)與否與細(xì)菌結(jié)合纖連蛋白原的能力、蛋白酶的產(chǎn)生息息相關(guān)，這兩者共同作用影響著葡萄球菌生物膜的形成能力；同時(shí)當(dāng)sarA被抑制時(shí)還能在體內(nèi)外增加細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性——當(dāng)sarA被抑制時(shí)，葡萄球菌生物膜形成能力減弱，感染組織中浮游生長(zhǎng)的葡萄球菌增多，與完全完整的生物膜相比，這大大增加了抗生素和機(jī)體免疫應(yīng)答對(duì)葡萄球菌的接觸面與接觸時(shí)間[24-26]。

sarA還是一個(gè)中心調(diào)節(jié)元素，能夠直接調(diào)節(jié)一些基因來(lái)影響細(xì)菌生物膜的形成。如：sarA可以通過(guò)直接結(jié)合啟動(dòng)子正向調(diào)節(jié)bap（bap是金黃色葡萄球菌的一種細(xì)胞壁黏附素）；sarA對(duì)多糖黏附素（PIA）的合成起至關(guān)重要的作用，sarA的缺失會(huì)導(dǎo)致PIA合成減少，當(dāng)然這是基于sarA是icaABCD操縱子的轉(zhuǎn)錄激活子，它控制著icaABCD的表達(dá)進(jìn)而影響PIA的合成[10，27]。

3.2 agr對(duì)生物膜形成的影響

附屬基因調(diào)節(jié)子系統(tǒng)由約3.5 kb的一段序列編碼，編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)，該序列包含RNAⅡ和RNAⅢ兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位。其轉(zhuǎn)錄取決于各自P2和P3 agr啟動(dòng)子的活化。研究表明，agr調(diào)控葡萄球菌生長(zhǎng)主要是在指數(shù)期和穩(wěn)定期[28-29]。agr群體感應(yīng)系統(tǒng)是通過(guò)感測(cè)生長(zhǎng)間期葡萄球菌所產(chǎn)生的自動(dòng)誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIPs）的細(xì)胞外水平而起作用的。在生物膜形成的起始和成熟階段agr是低表達(dá)的，而在生物膜成熟后期agr表現(xiàn)為活化。agr誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)菌的酶和毒素上調(diào)而黏附素下調(diào)。

3.2.1 RNAⅡ RNAⅡ由4個(gè)基因組成，分別是agrA、agrB、agrC和agrD。通過(guò)agrD基因的的轉(zhuǎn)錄合成AIPs的骨架。agrB轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是一種蛋白酶，其切割agrD產(chǎn)物的部分以形成長(zhǎng)度為約8個(gè)氨基酸的硫醇內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，即為AIPs[21，29]。AIPs作為信號(hào)分子，以濃度依賴關(guān)系參與群體感應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。agrC和agrA分別對(duì)應(yīng)于細(xì)菌中經(jīng)典雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的感應(yīng)傳感器和響應(yīng)調(diào)節(jié)劑，當(dāng)AIPs達(dá)到閾值濃度，可通過(guò)與跨膜蛋白結(jié)合激活agrC，在sarA的輔助下促進(jìn)agrA的磷酸化或去磷酸化，從而激活啟動(dòng)子P2和P3，最后導(dǎo)致RNAⅡ和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄[29-30]。

3.2.2 RNAⅢ RNAⅢ是agr系統(tǒng)的主要下游效應(yīng)物，通過(guò)與其下游基因的翻譯元件相互作用而起作用，如：通過(guò)RNA堿基配對(duì)在翻譯水平上影響其靶基因表達(dá)；抑制翻譯起始；其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)和Rot轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Rot是一個(gè)多效性調(diào)節(jié)子，影響多種毒素和表面蛋白的表達(dá)，也可以通過(guò)影響mRNA穩(wěn)定性、促進(jìn)或抑制mRNA翻譯來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平基因的表達(dá)[28]。Rot的表達(dá)水平與agr密切相關(guān)，尤其是與其中的RNAⅢ表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。Rot蛋白是維持金黃色葡萄球菌生物膜完整性所必需的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。具體來(lái)說(shuō)，agr失活導(dǎo)致RNAⅢ表達(dá)減少，RNAⅢ不能抑制Rot翻譯，這就增加了Rot介導(dǎo)的蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄的抑制，促進(jìn)分泌的蛋白酶的活性增高，導(dǎo)致生物膜形成。有研究表明，在葡萄球菌生物膜中觀察到agr操縱子和agr系統(tǒng)的調(diào)節(jié)分子在RNAⅢ中的基因表達(dá)顯著降低[29-31]。

3.2.3 agr與生物膜播散的關(guān)系 在生物膜成熟階段中的agr活性是被抑制了的，agr為低表達(dá)，而隨著生物膜的發(fā)展，從生物膜上分散的小細(xì)菌菌落中顯示出高水平的agr活性，AIPs能誘導(dǎo)agr的活化，同時(shí)生物膜的分散也通過(guò)agr蛋白酶調(diào)節(jié)系統(tǒng)介導(dǎo)。agr的激活可導(dǎo)致編碼細(xì)胞表面蛋白、黏附素蛋白A、sasG、sasC和纖連蛋白結(jié)合的基因下調(diào)。因此，agr在浮游細(xì)菌和生物膜之間的存在方式起著重要調(diào)控作用，有助于金黃色葡萄球菌的分散和新的表面黏附[10，32]。另外一類agr調(diào)節(jié)生物膜分散的因子是水溶性苯酚效應(yīng)（phenol-soluble modulins，PSMs），PSMs是金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)依賴性生物膜結(jié)構(gòu)和分離的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在生物膜成熟后，agrC可促進(jìn)PSMs物的產(chǎn)生使細(xì)菌從成熟的生物被膜中分離開(kāi)來(lái)，發(fā)生遠(yuǎn)處播散，引起其他器官的感染或?qū)е赂腥具w延不愈[24，33-34]。那么，如何通過(guò)agr來(lái)抑制群體感應(yīng)進(jìn)而抑制細(xì)菌生物膜形成已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。endprint

3.3 aap結(jié)構(gòu)及對(duì)生物膜形成的影響

在表皮葡葡萄球菌RP62A菌株中，aap是140 kD的蛋白質(zhì)，由N端信號(hào)肽、A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、P/G富集結(jié)構(gòu)域和C端LPDTG細(xì)胞壁錨鏈基序組成。aap是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域蛋白，在A結(jié)構(gòu)域的N末端含有可變數(shù)量為16個(gè)氨基酸的重復(fù)序列。B結(jié)構(gòu)域包含3～12個(gè)重復(fù)的128個(gè)氨基酸的G5和E結(jié)構(gòu)域。G5能自我結(jié)合，因此它是B結(jié)構(gòu)域重復(fù)功能重要組成部分，可協(xié)調(diào)app依賴的細(xì)胞間相互作用；E結(jié)構(gòu)域位于G5之間，可能防止蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊。B結(jié)構(gòu)域是aap蛋白中變異最大的區(qū)域，不同菌株aap蛋白在該區(qū)域所含有的重復(fù)序列不同，而B(niǎo)結(jié)構(gòu)域和小堿蛋白異型交互作用是生物膜基質(zhì)的一個(gè)組成部分，有助于aap依賴的生物膜形成[35-36]。通過(guò)Zn2+依賴性機(jī)制作用于暴露的B結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞聚集黏附，促使相鄰細(xì)胞間的親和及相互作用[37]。研究表明，在葡萄球菌RP62A培養(yǎng)時(shí)，aap出現(xiàn)在其生物膜形成的黏附階段的細(xì)胞外蛋白中，且僅在生物膜形成過(guò)程中觀察到細(xì)胞外液中aap的存在，在浮游的細(xì)菌細(xì)胞中aap不被表達(dá)，因此認(rèn)為其與表皮葡萄球菌的黏附和聚集密切相關(guān)[38-39]。

3.4 ica對(duì)生物膜形成的影響

3.4.1 ica結(jié)構(gòu)及功能 ica基因座存在于細(xì)菌染色體，全長(zhǎng)約3.4 kb，其包括調(diào)節(jié)基因icaR以及4個(gè)串聯(lián)基因icaA、icaB、icaC、icaD。icaABCD共同參與編碼，合成表皮葡萄球菌PIA[40-41]。PIA是由多聚-β（1-6）-乙酰氨基葡萄糖及線性糖胺聚糖組成，它是介導(dǎo)表皮葡萄球菌生物膜形成聚集階段的必需物質(zhì)，有助于細(xì)菌逃避宿主免疫反應(yīng)，還能介導(dǎo)生物膜對(duì)親水表面的依從性。icaA的產(chǎn)物是由UDP-N-乙酰葡糖胺合成PIA寡聚物的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，具有活性。icaB的產(chǎn)物是負(fù)責(zé)PIA部分脫乙酰化的N-脫乙酰酶，icaC的產(chǎn)物參與新生多糖向外部分泌和形成，而icaD的產(chǎn)物為icaA的編碼與合成提供了最佳的效率[42]。葡萄球菌細(xì)胞膜外聚合物包括PIA、eDNA、蛋白質(zhì)、淀粉樣蛋白樣纖維等，它們共同為細(xì)菌的黏附與聚合提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其中最為重要的就是PIA。目前的研究表明，ica不僅與葡萄球菌生物膜的形成相關(guān)，而且在醫(yī)源性材料或器械相關(guān)感染中也起著重要的作用[43]。因此，ica操縱子的表達(dá)已成為評(píng)價(jià)表皮葡萄球菌感染致病性的毒力標(biāo)志，且細(xì)菌生物膜形成陽(yáng)性的表皮葡萄球菌大多存在ica操縱子[21，41]。

3.4.2 icaR 位于表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中icaABCD操縱子上游分離轉(zhuǎn)錄的icaR基因是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子tetR家族的成員，大約為22 kD的蛋白質(zhì)，在icaR mRNA的5′和3′非翻譯區(qū)堿基配對(duì)控制其在葡萄球菌中的轉(zhuǎn)錄。icaR基因編碼的產(chǎn)物在葡萄球菌中ica操縱子表達(dá)的環(huán)境調(diào)節(jié)中具有轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用，其通過(guò)結(jié)合到細(xì)菌DNA的5′端的icaA，在icaA-icaR基因間區(qū)域的短核苷酸序列中可以直接影響icaADBC的表達(dá)。此外，在icaABCD與icaR同時(shí)存在的菌株中，外部環(huán)境變化（如：乙醇、葡萄糖加入）可以促使icaABCD操縱子的表達(dá)增加，促進(jìn)生物膜的形成[44-45]。ica操縱子是調(diào)節(jié)葡萄球菌生物膜形成的重要基因，不僅受sar、icaR調(diào)控影響，也受luxS、rbf、ccpA等基因調(diào)控蛋白的影響，因此對(duì)ica操縱子的多樣性研究有待更深入的探索與發(fā)現(xiàn)。

4 展望

生物膜是細(xì)菌形成的一種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)菌本身來(lái)說(shuō)，它對(duì)細(xì)菌的生存、增殖和轉(zhuǎn)移起著重要作用；而對(duì)人類來(lái)說(shuō)，生物膜的存在卻是巨大的擔(dān)憂，生物膜讓細(xì)菌對(duì)抗生素治療不敏感，降低療效。由于生物膜的形成復(fù)雜，參與因素多，所以近年來(lái)對(duì)生物膜的研究也呈多樣化發(fā)展的趨勢(shì)，因?yàn)槊恳粋€(gè)參與生物膜形成的必要因素均可能成為攻克生物膜的突破點(diǎn)。但也是由于生物膜的形成復(fù)雜，所以研究進(jìn)程緩慢，不夠深入，有些問(wèn)題需要進(jìn)一步探究，如：不同類固醇激素濃度如何影響細(xì)菌生物膜形成；如何以ica、agr等相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)作為抗細(xì)菌生物膜形成或促進(jìn)細(xì)菌生物膜崩解的臨床藥物研究等。因此，防止細(xì)菌黏附聚集和消除已建立的生物膜，對(duì)于一個(gè)創(chuàng)新的科學(xué)界來(lái)說(shuō)是越來(lái)越大的挑戰(zhàn)。

細(xì)菌生物分子的研究可能是未來(lái)生產(chǎn)有效的抗菌策略的關(guān)鍵，這些策略專門針對(duì)根除病原菌，這種方法可以解決感染，達(dá)到治療目標(biāo)，減少潛在的全身副作用，而不會(huì)增加抗生素耐藥性的威脅。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，細(xì)菌基因型必須系統(tǒng)地與生物分子途徑相關(guān)聯(lián)，從而允許最佳靶向的篩選。

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（收稿日期：2017-11-12 本文編輯：王 娟）endprint