褐飛虱組蛋白H3與H2A基因啟動(dòng)子克隆與序列分析

彭雷+趙艷+馬銀花

摘要：褐飛虱是對(duì)水稻危害最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，目前缺少對(duì)褐飛虱內(nèi)源高效啟動(dòng)子的研究。以褐飛虱的組蛋白H3與H2A基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)已知的果蠅H3與H2A序列搜尋Genbank上褐飛虱表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，簡(jiǎn)稱(chēng)EST）數(shù)據(jù)庫(kù)，從而獲得同源序列來(lái)設(shè)計(jì)嵌套引物。然后通過(guò)染色體步移的交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)Tail-PCR）技術(shù)獲得H3與H2A ATG前側(cè)翼序列，分別為1 664、538 bp。PLACE軟件在線(xiàn)分析TATA框、CAAT框、GATA框。為外源基因在褐飛虱細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)以及褐飛虱轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：褐飛虱；組蛋白H3；組蛋白H2A；啟動(dòng)子；Tail-PCR；基因工程

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.112+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0030-03

在基因工程研究中常常需要目的基因高效表達(dá)，于是分離強(qiáng)啟動(dòng)子已成為目前基因工程的基礎(chǔ)工作之一。高等動(dòng)植物的基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受各類(lèi)順式調(diào)控元件與反式調(diào)控元件協(xié)同調(diào)控。高等生物啟動(dòng)子主要分為3類(lèi)，第1類(lèi)為組成型表達(dá)啟動(dòng)子，這類(lèi)啟動(dòng)子一般調(diào)控看家基因表達(dá)。組成型啟動(dòng)子在所有組織中都能啟動(dòng)基因的表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性；第2類(lèi)為組織特異型啟動(dòng)子，一般調(diào)控基因在特定組織和器官中表達(dá)；第3類(lèi)為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，一般受某種信號(hào)誘導(dǎo)開(kāi)啟基因表達(dá)，讓基因在特定發(fā)育時(shí)期或特定組織器官、特定生長(zhǎng)環(huán)境下表達(dá)[1]。其中組成型表達(dá)啟動(dòng)子應(yīng)用比較廣泛，主要應(yīng)用于目的基因超量表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因研究中?？醇一騽e稱(chēng)持家基因（house-keeping genes），是指所有細(xì)胞中組成型表達(dá)的一類(lèi)基因，其產(chǎn)物是維持細(xì)胞各種基本生命活動(dòng)所必需的[2]。褐飛虱（Nilaparvata lugens Stl）是危害水稻最大的害蟲(chóng)之一，我國(guó)目前有1 300萬(wàn)～2 000萬(wàn)hm2 水稻受到褐飛虱危害[3]，對(duì)褐飛虱的研究成為農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治重要課題之一。目前在褐飛虱分子生物學(xué)中缺少對(duì)其自身基因內(nèi)源啟動(dòng)子的研究，相關(guān)研究也較少。以分離褐飛虱看家基因啟動(dòng)子序列為目的，用染色體步移技術(shù)得到組蛋白H2A與H3基因ATG前啟動(dòng)子序列，并對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與特征分析。本研究以分離組成型表達(dá)基因啟動(dòng)子為目的，為外源基因在褐飛虱細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)以及褐飛虱轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試褐飛虱飼養(yǎng)在溫室，溫室的溫度條件為22～28 ℃，保持合適的光照和濕度條件，以保證水稻和褐飛虱在良好環(huán)境下生長(zhǎng)。Top 10感受態(tài)細(xì)胞為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。Genome walking試劑盒、PMD18-T Simple Vector、DNA solution I均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega儀器儀表有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2褐飛虱DNA提取

褐飛虱基因組DNA提取皆為單頭蟲(chóng)提取。所用方法為十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，簡(jiǎn)稱(chēng)CTAB）法參照文獻(xiàn)[4-5]，并略有改動(dòng)。將采集的單頭褐飛虱放入裝有400 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% CTAB的 1.5 mL 離心管中，用勻漿小棒搗碎勻漿，將勻漿液放入 60 ℃ 水浴鍋水浴裂解60 min，向裂解后的勻漿液中加入200 μL三氯甲烷/異戊醇（體積比為24 ∶1）抽提2次，加入2倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃條件下沉淀；最后將風(fēng)干后的DNA溶于 50 μL TE中，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3擴(kuò)增引物

目前褐飛虱H3、H2A序列還沒(méi)有被公布，用果蠅的H3、H2A mRNA序列在NCBI的褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，這樣就獲得與果蠅H3、H2A高度同源的EST片段，以EST片段序列為模板來(lái)設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.4Tail-PCR擴(kuò)增

3輪反應(yīng)總體系50 μL，包括1 μL模板；2.5 mmol/L dNTPs 8 μL；10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ plus）5 μL；LA Taq（5 U/μL）0.5 μL；隨機(jī)引物與特異引物（100 pmol/μL）各 1 μL；加入dH2O至總體積50 μL。以H3第1次Tail-PCR為例，試劑盒的AP2、AP3、AP4引物分別首先與H3W1-1引物進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為模板再加入各自對(duì)應(yīng)AP簡(jiǎn)并引物和H3W1-2進(jìn)行第2輪，同理以H3W1-2和AP引物進(jìn)行第3輪擴(kuò)增，第3輪擴(kuò)增結(jié)束后電泳跑膠并選取擴(kuò)增帶型效果好的一組組合。PCR反應(yīng)條件參照Genome Walking試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒回收后和PMD18-T載體按濃度比為3 ∶1混合，加入等體積DNA solution I，16 ℃連接5 h。將連接片段轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基平板，37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白色菌落。以載體通用測(cè)序引物M13-47和RV-M進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)插入片段大小，將陽(yáng)性克隆的菌液送出測(cè)序。序列先在Genbank Blastn上進(jìn)行比對(duì)，確定是否為目的序列。通過(guò)PLACE在線(xiàn)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析啟動(dòng)子功能元件。

2結(jié)果與分析

2.1Tail-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)于H3基因和H2A基因各自3條特異引物和試劑盒AP2、AP3、AP4簡(jiǎn)并引物組合，3輪熱不對(duì)稱(chēng)PCR后，H3基因的AP3的組合能擴(kuò)增到1條約900 bp的片段（圖1-a），H2A基因的AP3組合能擴(kuò)增到1條約800 bp的片段（圖1-b）。將擴(kuò)增到的片段T-A克隆測(cè)序后在Genbank上進(jìn)行Blastn比對(duì)，證實(shí)為褐飛虱H3、H2A基因ATG前端序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，又設(shè)計(jì)3條特異性引物繼續(xù)對(duì)H3向前walking，交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，簡(jiǎn)稱(chēng) Tail-PCR）獲得約1.1 kb片段（圖1-c），測(cè)序后將其與前面測(cè)序結(jié)果拼接。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，獲得H3 ATG前端1 664 bp序列，獲得H2A ATG前端538 bp序列。endprint

2.2啟動(dòng)子序列分析

將得到H3與H2A ATG上游序列與Genbank上的褐飛虱

EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，H3 5′非翻譯區(qū)（untranslated region，簡(jiǎn)稱(chēng)UTR）有1條549 bp的內(nèi)含子（圖2），H2A起始密碼子ATG后有一段143 bp的內(nèi)含子序列（圖3）。PLACE軟件在線(xiàn)分析預(yù)測(cè)TATA框、GAAT框、CAAT框等啟動(dòng)子核心原件（圖2、圖3）。

3討論

真核生物DNA是以染色質(zhì)形式存在的，而染色質(zhì)的基本組成單位為核小體，核小體則由核心組蛋白組成，其組成方式為以組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個(gè)分子形成八聚體，DNA則纏繞在此八聚體上形成核小體[6]。茅衛(wèi)峰等克隆了虹蹲魚(yú)H3的啟動(dòng)子序列并將H3啟動(dòng)子插入啟動(dòng)子缺失的增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，簡(jiǎn)稱(chēng)EGFP）表達(dá)載體pEGFP-1中，通過(guò)顯微注射法注射重組載體，結(jié)果表明，H3啟動(dòng)子能啟動(dòng)報(bào)告基因EGFP在各組織中的高效表達(dá)[7]。DNA未知區(qū)域序列克隆一般采用染色體步移技術(shù)，染色體步移技術(shù)主要基于2種方法，1種是基于基因組文庫(kù)為主要手段的染色體步移技術(shù)，另1種是基于PCR技術(shù)的染色體步移技術(shù)。基于PCR的染色體步移技術(shù)又主要以連接成環(huán)PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR和半隨機(jī)引物PCR技術(shù)為主[8]?；陔S機(jī)引物的PCR技術(shù)的熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR（Tail-PCR）是比較常用的獲得側(cè)翼序列的方法，由Liu等最早設(shè)計(jì)[9]，其原理是基于巢式PCR，利用3個(gè)嵌套的特異引物和1個(gè)較短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行3次熱不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，逐漸擴(kuò)增到特異性的目的基因產(chǎn)物。本研究首先通過(guò)果蠅的組蛋白H3基因和H2A基因序列在褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋同源序列，以此獲得褐飛虱H3、H2A基因的部分序列，然后設(shè)計(jì)嵌套特異引物，通過(guò)Tail-PCR技術(shù)獲得H3、H2A基因ATG前端序列，分別為1 664、538 bp，并對(duì)獲得的ATG前端側(cè)翼序列運(yùn)用PLACE軟件在線(xiàn)分析其啟動(dòng)子元件。本研究為外源基因在褐飛虱細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)以及褐飛虱轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

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