楊國慧+范婷婷+陳效杰+史影肖+呂孟杰+王昱文+趙珺祺+韓德果
摘要:為了解樹莓葉、果中水楊酸含量變化及其抑菌性能,采用高效液相色譜法測定6個(gè)不同樹莓品種不同生長時(shí)期和不同成熟度果實(shí)中的水楊酸含量,并以現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌和大腸桿菌為材料分析其真菌、細(xì)菌抑菌性。結(jié)果表明,夏果型品種結(jié)果枝葉片水楊酸含量最高期出現(xiàn)在5月末,秋果型品種則出現(xiàn)在6月末,最高含量分別為2032、2.157 mg/g;樹莓果實(shí)成熟期水楊酸含量最高為1.390 mg/g;樹莓葉片和果實(shí)中水楊酸對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑菌率最高分別為35.83%、81.72%。樹莓葉、果中水楊酸含量葉片高于果實(shí),對(duì)大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于番茄灰霉病菌的抑菌效果。
關(guān)鍵詞:樹莓;水楊酸含量;果實(shí);葉片;抑菌性;高效液相色譜法
水楊酸(salicylic acid,簡稱SA)是植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚類化合物,作為精細(xì)有機(jī)合成中間體,可以用于香料、化妝品、防腐劑、配制動(dòng)物性香精等[5-8];同時(shí)水楊酸具有消炎、抗風(fēng)濕、解熱止痛的功效,對(duì)青霉、灰霉、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種菌類具有抑制作用,為化工醫(yī)藥工業(yè)的重要原料[9-10]?,F(xiàn)有資料報(bào)道,樹莓葉片和果實(shí)中均含有豐富的水楊酸,含量可達(dá)1.434 mg/g[11-13]。但樹莓不同品種之間、同一品種不同生長時(shí)期葉片和不同成熟度果實(shí)中水楊酸含量存在多大差異,樹莓葉片和果實(shí)中水楊酸抑菌性如何,尚未有報(bào)道。
高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,簡稱HPLC)目前被廣泛用于檢測食品和藥品中的水楊酸含量。本研究以樹莓的不同品種為材料,利用高效液相色譜法,測定其不同發(fā)育時(shí)期葉片、不同成熟期果實(shí)中水楊酸的含量,并利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和大腸桿菌(Escherichia coli)分析其抑菌效果,探討樹莓葉、果中水楊酸的生理活性性能,為今后樹莓葉、果的工業(yè)化利用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
試驗(yàn)以黑龍江地區(qū)廣泛種植的三年生樹莓栽培品種為材料,采用夏果型品種:美22(American Twenty-two)、DNS22、費(fèi)爾杜德(Fertod Zamatos);秋果型品種:秋福(Autumn Bliss)、金秋(Fall Gold)、哈瑞太茲(Heritage)。于2013年5、6、7、8、9月末分別采集上述品種結(jié)果枝成熟葉片以及不同成熟期(綠果期、轉(zhuǎn)白期、成熟期、過熟期)的果實(shí),澆上液氮,-80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。
1.2方法
1.2.1水楊酸的提取水楊酸提取參照張衛(wèi)等的方法[15]。具體過程如下:取葉1.0 g或果2.0 g,研磨勻漿,20 mL 90%甲醇,10 000 r/min離心30 min,重復(fù)2次,合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸干,15 mL 5%三氯乙酸加40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次,合并下層水相,15 mL 8 mol/L HCl密封,80 ℃ 恒溫水浴60 min,40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次,合并上層有機(jī)相,旋轉(zhuǎn)蒸干,30 mL 80%色譜級(jí)甲酸溶解,20%(0.2 mol/L,pH值為5.5)乙酸鈉定容,0.45 μm微孔過濾,濾液置于冰箱冷藏層保存。
1.2.2水楊酸含量的測定Waters2695色譜儀,色譜柱型號(hào)依利特SinoChrom C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)柱,流動(dòng)相甲醇、乙酸鈉(0.2 mol/L pH值為5.5)體積比6 ∶4混合液,進(jìn)樣 10 μL,流速0.5 mL/min,紫外吸收波長296 nm,水楊酸標(biāo)樣來自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,甲醇(色譜級(jí))來自生工生物工程(上海)股份有限公司。
水楊酸的計(jì)算公式:
葉片y=30x/1 000;果實(shí)y=30x/2 000。
式中:x表示水楊酸濃度,μg/mL;y表示水楊酸含量,mg/g。
1.2.3水楊酸抑菌性分析使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保存菌種,真菌為番茄灰霉病菌,細(xì)菌為大腸桿菌。真菌抑菌性分析采用十字交叉法,PDA培養(yǎng)基培養(yǎng),將6 mm菌餅接入60%水楊酸提取液抑菌平板的中央,26 ℃恒溫培養(yǎng),5 d后調(diào)查菌落直徑;細(xì)菌抑菌性分析采用菌落計(jì)數(shù)法,將供試菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中,置于搖床中于30 ℃培養(yǎng)48 h,稀釋107后吸取 200 μL 涂抹到制成的抑菌平板上,48 h后進(jìn)行菌落記數(shù)。上述試驗(yàn)均以加入60%甲醇的平板為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù)。
真菌抑菌率SA=[(A0-6)-(A1-6)/(A0-6)]×100%;細(xì)菌抑菌率SA=[(A0-A1)/A0]×100%。
式中:A0為空白對(duì)照(60%甲醇流動(dòng)相)真菌菌落直徑(mm)或細(xì)菌菌落數(shù);A1為加入水楊酸提取液的真菌菌落直徑(mm)或細(xì)菌菌落數(shù)。
1.3數(shù)據(jù)分析
采用SPSS與Excel分析數(shù)據(jù)。
2結(jié)果與分析
2.1樹莓結(jié)果枝葉片不同時(shí)期水楊酸含量變化
美22、DNS22、費(fèi)爾杜德屬夏果型品種,結(jié)果后結(jié)果枝葉片易干枯脫落,因此美22、DNS22在9月末未采集到葉片,而費(fèi)爾杜德8月末就沒有采集到葉片。由圖1可見,夏果型樹莓3個(gè)品種美22、DNS22、費(fèi)爾杜德5月葉片水楊酸含量最高,3個(gè)品種含量高低表現(xiàn)為費(fèi)爾杜德 2.2不同成熟期樹莓果實(shí)中水楊酸含量的變化 圖2表明,樹莓果實(shí)中水楊酸含量和其成熟度有關(guān):6個(gè)樹莓品種均隨著果實(shí)逐漸成熟,水楊酸含量逐步升高,成熟期達(dá)到最高值,而隨著過熟,含量又表現(xiàn)為降低。其中,哈瑞太茲成熟期水楊酸含量最高,為1.390 mg/g。6個(gè)樹莓品種果實(shí)的水楊酸含量變化趨勢一致,并沒有因?yàn)榉N類不同出現(xiàn)差異,出現(xiàn)高峰時(shí)期相同,均為成熟期。
2.3樹莓葉片和果實(shí)水楊酸含量比較
以6個(gè)樹莓品種葉片和果實(shí)中的水楊酸含量最高時(shí)期進(jìn)行比較,圖3表明,6個(gè)樹莓品種葉片中水楊酸含量均高于果實(shí)中的水楊酸含量,因此葉片中水楊酸含量并未因?yàn)槠贩N不同而不同。
2.4樹莓水楊酸提取液的抑菌能力
6個(gè)樹莓品種不同月份葉片和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用,其中DNS22在5月末的葉片和哈瑞太茲在綠果期的果實(shí)中水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病抑菌率最高,抑菌率分別為 25.89%、35.83%(圖4、圖5);金秋在8月末的葉片和轉(zhuǎn)白期的果實(shí)中水楊酸提取液對(duì)大腸桿菌抑菌率最高,抑菌率分別為81.72%、78.38%(圖6、圖7)。但不同品種、不同生長發(fā)育時(shí)期的果實(shí)和葉片水楊酸提取液對(duì)番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑制能力沒有和其水楊酸含量表現(xiàn)出一致的相關(guān)關(guān)系。
3結(jié)論與討論
試驗(yàn)中采用HPLC法測定樹莓葉片水楊酸含量在0.350~2.157 mg/g之間,果實(shí)中水楊酸含量為0.142~1.390 mg/g,且葉片中水楊酸含量高于果實(shí)中。年四輝等測得不同廠家板藍(lán)根藥材中的水楊酸含量,最高為 0.131 4 mg/g[16];黃智鴻等測得不同時(shí)期榆錢中總水楊酸的含量最高為0.176 mg/g[17];劉紹歡等測得不同地區(qū)透骨香中水楊酸最高含量為 0.205 mg/g[18]。和其他植物種類相比, 樹莓中的水楊酸含量
較高,尤其是樹莓葉片。
本研究結(jié)果中不同類型樹莓品種結(jié)果枝葉片中水楊酸含量高峰值出現(xiàn)時(shí)間不同:夏果型水楊酸5月含量最高,而秋果型品種水楊酸含量6月達(dá)到最大,這可能和不同類型品種的生長特性以及生產(chǎn)中采用的栽培措施有關(guān)。夏果型品種結(jié)果枝為二年生枝條,其上葉片萌發(fā)早,所以葉片水楊酸含量高峰期出現(xiàn)也早一些。果實(shí)成熟采摘后,結(jié)果枝上的葉片逐漸衰老、水楊酸含量顯著降低;秋果型品種一年生枝條為主要結(jié)果枝,春季萌芽前進(jìn)行平茬,葉片萌發(fā)較晚,水楊酸含量的高峰值出現(xiàn)時(shí)間也晚一些。嚴(yán)涵薇等采用HPLC法測定了5種玉米自交系玉米種水楊酸含量,顯示自交系間水楊酸含量大致相同,在1.36~1.51 μg/g之間[19]??赡苡衩字兴畻钏醿H作為一種調(diào)節(jié)因子,微量即可調(diào)節(jié)植物生長。試驗(yàn)中同時(shí)測定了3種顏色不同果實(shí)(紅樹莓:費(fèi)爾杜德、秋福、哈瑞太茲;黃樹莓:DNS22、金秋;紫樹莓美22),發(fā)現(xiàn)水楊酸含量和果實(shí)色澤關(guān)系不大,主要和果實(shí)成熟度有關(guān),成熟期果實(shí)含量最高。
水楊酸對(duì)真菌、細(xì)菌等具有一定的抑制作用。申曉慧等研究了水楊酸細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌的抑制作用,對(duì)3種菌抑制效果均表現(xiàn)明顯,且抑菌效果隨水楊酸濃度的增加而增強(qiáng)[20]。鄭國興等測得水楊酸對(duì)白色假絲酵母(Canidia albicans)、黑曲霉(Aspergillus nige)的抑菌率可分別達(dá)到75%、60%[21]。本研究結(jié)果顯示,樹莓葉片、果實(shí)提取液對(duì)真菌、細(xì)菌均有一定的抗性,最高分別達(dá)到35.83%、81.72%,對(duì)大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌性。水楊酸HPLC法測定分析與抑菌性試驗(yàn)表明,樹莓水楊酸含量豐富,且葉片含量高于果實(shí),6個(gè)樹莓品種中,哈瑞太茲綠果期果實(shí)和金秋8月末葉片提取水楊酸抑菌性較高,可以作為醫(yī)藥工業(yè)的理想原材料。
參考文獻(xiàn):
[1]宣景宏,孟憲軍,劉春菊,等. 樹莓的主要功效成分及開發(fā)利用前景[J]. 中國果業(yè)信息,2007,24(1):26-28.
[2]Kim M J,Sutton K L,Harris G K.Raspberries and related fruits[J]. Reference Module in Food Science,2016:586-591.
[3]黎慶濤,王遠(yuǎn)輝,王麗. 樹莓功能因子研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑,2011(2):172-177.
[4]Kumari P,Barman K,Patel V B,et al. Reducing postharvest pericarp browning and preserving health promoting compounds of litchi fruit by combination treatment of salicylic acid and chitosan[J]. Scientia Horticulturae,2015,197(14):555-563.
[5]劉洪蛟,雷鳴,胡艷麗,等. HPLC法測定鏈莢豆根中水楊酸的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,30(5):356-358.
[6]薛峰,林毅侃,馬躍龍,等. 食品中水楊酸含量測定方法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(14):429-431.
[7]董風(fēng)強(qiáng),周國俊,蔣健,等. 高效液相色譜法測定香精香料中的水楊酸[J]. 廣州化工,2009,37(4):139-140.
[8]季丹丹,劉艷紅,祝鈞. 化妝品用水楊酸酯類衍生物的制備及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 日用化學(xué)工業(yè),2015,45(11):648-652.
[9]王若蘭,楊超,趙妍,等. 水楊酸處理對(duì)草莓采后品質(zhì)及灰霉病害的影響[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(5):24-28.
[10]葛暕,楊雙雙,陳全戰(zhàn),等. 金屬-水楊酸及其衍生物的配合物的合成及抗真菌性能[J]. 生物學(xué)通報(bào),2013,48(6):50-54.
[11]Mullen W,Yokota T,Lean M E J,et al. Analysis of ellagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry fruits by LC-MSn[J]. Phytochemistry,2003,64(2):617-624.
[12]杜龍飛,李潔,楊龍,等. 覆盆子的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26:1957-1960.
[13]趙偉偉,李愛民,張正,等. 海蓬蘽懸鉤子水楊酸提取工藝及含量變化研究[J]. 北方園藝,2014(16):127-130.
[14]葛秋來. 樹莓果實(shí)成熟軟化機(jī)理的初步研究[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.
[15]張衛(wèi),孫國新,徐玉新,等. 植物體內(nèi)水楊酸分析方法的探討及其應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2009,4(6):889-897.
[16]年四輝,李萍,劉麗敏,等. HPLC測定板藍(lán)根及其制劑中水楊酸、苯甲酸的含量[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(21):92-95.
[17]黃智鴻,史寶林,高寶嘉. HPLC測定榆錢中水楊酸的含量[J],中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)志,2014,20 (16):112-114.
[18]劉紹歡,梁光平,漆珍珍,等. 不同產(chǎn)地透骨香葉揮發(fā)油中水楊酸甲酯的含量測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(30):18498-18500.
[19]嚴(yán)涵薇,朱蘇文,江海洋. HPLC法分析玉米自交系水楊酸含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(22):11710-11711,11718.
[20]申曉慧,姜成. 水楊酸對(duì)食品中常見污染細(xì)菌的抑制作用研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(9):55-57.
[21]鄭國興,張春樂,黃浩,等. 水楊酸的抑酶與抑菌作用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào),2006,45(5):19-22.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第23期薩如拉,陳建興,春花,等. 利用高壓熱水法提取厚樸的有效精油成分[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(23):184-187.endprint