銀屑病動物模型研究進展

張同梅，王 剛

銀屑病是一種主要由T淋巴細胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，典型皮損表現(xiàn)為境界清楚的浸潤性紅斑和鱗屑。銀屑病的發(fā)病是遺傳、免疫及復(fù)雜環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[1]，其復(fù)雜的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。在疾病的發(fā)病機制和臨床前研究中，動物模型是必不可少的一項工具，而銀屑病卻是人類所特有的疾病，一般不發(fā)生在動物中。迄今發(fā)現(xiàn)的少量自發(fā)性突變小鼠如鱗片狀皮膚突變鼠（Ttc7fsn/Ttc7fsn突變鼠）[2]、慢性增生性皮炎突變鼠（cpdm/cpdm突變鼠）[3]，雖然具有類似人類銀屑病的丘疹、鱗屑或紅斑表現(xiàn)，但它們的皮損組織中均缺少T淋巴細胞浸潤，并且環(huán)孢素（cyclosporin A，CsA）或卡泊三醇等藥物對其無明顯療效，這些與人類銀屑病特征不符合。生物醫(yī)學(xué)動物模型如雌鼠陰道上皮模型、小鼠尾部鱗片模型等，因其不具備銀屑病炎癥特征，近年來運用也逐漸減少。缺乏合適的動物模型，為銀屑病的基礎(chǔ)研究和臨床前研究帶來了一定阻礙。近30年以來，研究者們構(gòu)建出了多種不同類型的銀屑病或“銀屑病樣”動物模型，這些模型都可在一定程度上模擬人類銀屑病的某些特征?，F(xiàn)有的應(yīng)用較廣泛的動物模型主要有4大類，包括急性炎癥模型、基因工程模型、異體移植模型和中醫(yī)特定證型動物模型。借助這些動物模型，對銀屑病的發(fā)病機制有了更進一步的了解，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了全新的治療藥物。本文旨在對現(xiàn)有的銀屑病動物模型做一綜述，為銀屑病動物水平的研究提供參考。

1 急性炎癥動物模型

銀屑病急性炎癥動物模型包括藥物誘導(dǎo)模型和皮膚屏障破壞模型。藥物誘導(dǎo)的方式包括局部外用、真皮內(nèi)注射和口服。常用的局部外用誘導(dǎo)藥物有咪喹莫特（imiquimod，IMQ）[4]、普萘洛爾[5]、12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）[6]、噁唑酮[7]等。其中IMQ誘導(dǎo)的小鼠模型應(yīng)用最為廣泛，其不僅較好地模擬了銀屑病樣的皮損表現(xiàn)，也一定程度地存在與銀屑病相似的固有免疫和獲得性免疫紊亂。真皮內(nèi)注射促炎細胞因子如白細胞介素（IL）-23[8]或抗原（如來源于釀酒酵母菌的甘露聚糖）[9]等，以及口服普萘洛爾[10]也可以誘導(dǎo)與銀屑病相似的皮膚炎癥和增生。皮膚屏障破壞模型是通過機械外力破壞動物皮膚屏障，如反復(fù)貼撕膠帶以剝離皮膚角質(zhì)層[11]，可用來模擬銀屑病的屏障失衡狀態(tài)。

急性炎癥模型相比于其他動物模型，具有花費少、省時、省力等優(yōu)點。這些誘導(dǎo)藥物不僅容易獲取，而且可以刺激多種遺傳背景的小鼠產(chǎn)生皮膚炎癥反應(yīng)，并可以根據(jù)研究需要，選取特定周齡的小鼠、在特定時間段來誘導(dǎo)銀屑病表型，為研究者們帶來極大的便利。然而，急性炎癥模型也有其局限性，最主要的局限性就在于這種用藥物誘發(fā)的皮膚炎癥是非特異性的，不只在銀屑病中，在其他疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特應(yīng)性皮炎等皮損中也有類似的炎癥表現(xiàn)。如TPA誘導(dǎo)的小鼠模型還被用于急性刺激性皮炎[12]，IMQ誘導(dǎo)的皮膚炎癥模型還被用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究[13]，這些疾病的發(fā)病機制均與銀屑病不同。其次，急性炎癥模型雖然應(yīng)用廣泛，但在構(gòu)建模型的過程中，普遍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作方案，不同實驗室、不同操作者在給藥的頻率、持續(xù)時間、藥物廠家、藥物劑量或濃度、動物飼養(yǎng)條件、動物遺傳背景、給藥部位等方面均可能不同，這些差異限制了研究的可重復(fù)性。如IMQ誘導(dǎo)的銀屑病模型，由于不同IMQ產(chǎn)品所用的基質(zhì)媒介不同，局部外用IMQ會產(chǎn)生不同的皮膚表型[14]，而給小鼠口服IMQ則會誘導(dǎo)出一種強烈的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[15]。最后，急性炎癥模型只適用于短期研究，并不能完全反映銀屑病患者的慢性炎癥狀態(tài)。

2 基因工程動物模型

基因工程動物模型是采用基因編輯技術(shù)，使小鼠體內(nèi)某種特定基因過表達或敲除。傳統(tǒng)的基因工程小鼠，即轉(zhuǎn)基因小鼠，采用同源重組的方法，對小鼠胚胎干細胞進行基因編輯，再使其發(fā)育成完整的個體，通過對該個體后代進行篩選，培育出攜帶修飾基因的純合子小鼠，這種小鼠在出生時其全身所有類型細胞即已經(jīng)具有目的基因修飾。如整體敲除IL-1受體拮抗蛋白的IL1RN-/-小鼠[16]，在其皮膚和耳郭自發(fā)性產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，伴有表皮增厚與角化不全；CD18缺陷小鼠，其自發(fā)產(chǎn)生的銀屑病樣表型，用抗CD4+T淋巴細胞的抗體治療有效，而抗CD8+T淋巴細胞抗體無效[17]?；蛘w敲除鼠的主要優(yōu)點在于其具有單一基因的缺失，這為在體研究特定基因缺陷的效應(yīng)及其遺傳和分子機制提供了便利，在人類疾病的病因?qū)W研究中有一定運用前景。該類模型的局限性在于其相對昂貴的花費，以及需要大量時間和人力，并且往往出現(xiàn)出生前死亡。此外，全身單一基因的表達改變并不能反映人體不同組織中的基因表達差異，也不能代表復(fù)雜的多基因相關(guān)疾病如銀屑病的遺傳背景。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究者們利用Cre/loxP（cyclization recombination enzyme/locus of X-over P1）系統(tǒng)，配合基因表達調(diào)節(jié)劑（如四環(huán)素、多西環(huán)素、他莫昔芬等），構(gòu)建出了具有組織特異性的條件性轉(zhuǎn)基因小鼠[18,19]。利用Cre重組酶能介導(dǎo)兩個loxP位點之間序列特異性重組或刪除的特點，分別構(gòu)建2種轉(zhuǎn)基因小鼠，一種小鼠的目的基因兩端分別含有一個loxP位點的基因序列，而Cre重組酶則被置于另一種小鼠組織特異性基因，如角蛋白（keratin，KRT）5、14等的啟動子調(diào)控之下，這兩種小鼠交配產(chǎn)生的后代中，同時含有上述兩種基因型的小鼠，就實現(xiàn)了目的基因在某一特定組織內(nèi)被敲除。同理，對目的基因進行過表達，則需要構(gòu)建含有過表達目的基因的小鼠，只是在該目的基因與啟動子之間含有一段翻譯終止序列，使得導(dǎo)入的目的基因不表達，將兩個loxP位點分別置于這段翻譯終止序列兩端，當(dāng)該小鼠與Cre小鼠進行交配，其后代具有兩種基因型的小鼠中，Cre重組酶作用于翻譯終止序列，使得目的基因得以表達。再配合基因表達誘導(dǎo)劑（如四環(huán)素、多西環(huán)素、他莫昔芬等），則可以對目的基因的表達時間進行調(diào)控?；蜻^表達的條件性轉(zhuǎn)基因小鼠，主要針對在銀屑病發(fā)病中起關(guān)鍵作用的基因，如在基底層角質(zhì)形成細胞中組成性激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3） 通路的KRT5-Stat3小鼠模型[11]，在表皮中過表達轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1的KRT5-TGF-B1小鼠模型[20]，在基底層過表達生長因子家族基因的血管內(nèi)皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A，KRT14-Vegf） 小 鼠[21]、角質(zhì)形成細胞（keratinocyte，KC）-血管生成素受體（Tie2）小鼠[22]，在表皮中過表達細胞因子的外皮蛋白（involucrin，IVL）-干擾素（interferon，IFN）-γ小鼠[23]、K5-IL-17C小鼠[24]等，這些小鼠模型均能自發(fā)產(chǎn)生或通過調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生銀屑病樣表型，在外觀與皮膚炎癥模式上均與人類銀屑病有不同程度的相似性。一些組織特異性敲除鼠也能出現(xiàn)銀屑病樣表型，如在表皮中敲除激活蛋白-1（activator protein1，AP-1）家族基因的KRT5-JunB/Jun小鼠，具有與銀屑病相似的皮膚炎癥表現(xiàn)和嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎[25]；在表皮中敲除核因子 κB (nuclear factor κB， NF-κB)通路相關(guān)基因如KRT14-IKKβ小鼠，表皮中IκB激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）的缺失導(dǎo)致 NF-κB活化，產(chǎn)生表皮增厚、分化異常和嚴(yán)重的皮膚炎癥表現(xiàn)[26]。理論上講，采用Cre/loxP系統(tǒng)，可以對動物體任何發(fā)育階段的任何組織或細胞中的任一基因進行條件性遺傳修飾，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。組織特異性的條件性轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)點在于實現(xiàn)了目的基因在空間和時間上的可控修飾，可以更準(zhǔn)確的模擬人類疾病狀態(tài)，為研究目的基因在特定組織或細胞中的功能和作用機制提供便利。并且，與整體修飾模型相比，由基因修飾導(dǎo)致的出生前死亡也大大降低。該模型局限性在于它價格更昂貴，建模耗時更長，并且對兩種以上的基因進行了修飾，可能不僅僅影響了目的基因的表達，此外，很多條件性轉(zhuǎn)基因模型需要使用基因調(diào)節(jié)劑如多西環(huán)素來調(diào)節(jié)表達，而調(diào)節(jié)劑的攝入方式或小鼠攝食行為的差異，可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)混雜因素和偏差。

此外，一些基因工程小鼠模型的基因修飾與銀屑病的基因表達模式相反，比如K17-/-小鼠[27]，這些動物模型本身并不出現(xiàn)銀屑病樣表型，但被修飾的目的基因在銀屑病發(fā)病過程中起了重要作用，利用這些模型可以深入研究發(fā)病機制，并探索這些目的基因作為治療靶點的潛在價值。

近5年出現(xiàn)的一項新的基因編輯技術(shù)——規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列與其相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced palindromic repeats -associated protein 9，CRISPR/Cas 9）系統(tǒng)，也開始被用于皮膚病學(xué)研究[28]，并且已被用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型來進行銀屑病的臨床前研究[29]。這項技術(shù)的優(yōu)點是能夠?qū)蜻M行精確編輯，與其他轉(zhuǎn)基因動物模型相比，在構(gòu)建模型的時間上大大縮短。這種模型的局限性在于它難以預(yù)測的脫靶效應(yīng)，會造成研究結(jié)果的不確定性以及工作量的增加。盡管CRISPR/Cas 9系統(tǒng)在皮膚科領(lǐng)域的應(yīng)用尚不多，但因其強大的基因編輯能力，使其具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 異體移植動物模型

異體移植模型包括異種移植模型和同種不同品系小鼠間移植模型。后者主要是指給免疫缺陷小鼠靜脈注射不同品系小鼠主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）不相容的免疫細胞進行免疫重建，如給癌癥研究學(xué)院（Institute of Cancer Research，ICR）來源的重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠靜脈注射來源于BalB/C小鼠的幼稚CD4+T淋巴細胞（CD45RBhi），4～8周后小鼠皮膚會出現(xiàn)銀屑病樣表型，包括表皮增厚、角化過度、角化不全、炎性細胞浸潤等，銀屑病相關(guān)細胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6等也有升高，該模型采用CsA和紫外線治療有效[30]。但是注射CD4+記憶性/效應(yīng)T淋巴細胞（CD45RBlo），卻不會出現(xiàn)銀屑病表型，2種細胞一起注射，只能表現(xiàn)出輕度的表型[30]。該模型的優(yōu)點是可部分模擬銀屑病T淋巴細胞免疫模式，但因種間差異的存在，對研究結(jié)果的解讀有一定局限性。

異種移植銀屑病動物模型是將人體組織或細胞移植給免疫缺陷小鼠，使移植物維持或產(chǎn)生銀屑病樣表型。最常用到的小鼠受體有裸鼠、SCID小鼠和AGR129小鼠[31]。裸鼠是T淋巴細胞免疫缺陷鼠，其胸腺退化不能產(chǎn)生成熟的T淋巴細胞，也無法產(chǎn)生T淋巴細胞依賴性的抗體，對移植物無排斥反應(yīng)。在裸鼠中移植的銀屑病皮損（psoriasis plaque skin，PP）可以保持2個月不改變銀屑病表型[32]。但宿主小鼠仍有產(chǎn)生T淋巴細胞非依賴性抗體的能力和正常的自然殺傷（NK）細胞功能，不利于移植物長期保持活性。

SCID小鼠是體液和細胞免疫雙重缺陷小鼠，但仍有正?；钚缘腘K細胞，盡管對實體組織移植物具有很好的接受度，但是單細胞懸液的移植卻能被迅速識別并消滅[33]。研究者對SCID小鼠移植銀屑病患者的非皮損組織（psoriasis non-lesional skin，PN）注射大量來源于供體的血液免疫細胞，發(fā)現(xiàn)PN逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镻P，而來源于正常人的皮膚組織（normal nonpsoriasis control，NN）并沒有發(fā)生轉(zhuǎn)變[34]。這種模型已被用于臨床前研究，用于評估新藥物的療效[35]。

AGR129小鼠具有三重免疫缺陷，同時缺失T淋巴細胞、B淋巴細胞和成熟的NK細胞。將PN組織移植到AGR小鼠背部，6～8周后PN自發(fā)性的轉(zhuǎn)變?yōu)镻P，而NN并沒有發(fā)生轉(zhuǎn)變，給予異種移植小鼠模型靜脈注射抗CD3抗體進行治療，則可以阻止PN向PP轉(zhuǎn)變[36]，這種自發(fā)性異體移植模型提示，PN中定植的T淋巴細胞（尤其是CD8+T淋巴細胞）在移植物中擴增起了關(guān)鍵性作用，而受體小鼠的NK細胞可能會妨礙移植物中定植T淋巴細胞的擴增，當(dāng)NK細胞缺陷時，供體的免疫細胞尤其是T淋巴細胞更容易誘導(dǎo)PN向PP轉(zhuǎn)變[37]。

異種移植模型的主要優(yōu)點在于采用了人體來源的組織，最接近人類疾病的免疫和遺傳基礎(chǔ)，在臨床前研究中，對于觀察新藥物的療效、代謝、不良反應(yīng)等均有很大優(yōu)勢[38]。然而，構(gòu)建這種模型需要較大量的供體組織，供體取材后需要立即進行移植以防止移植物缺血，對操作技術(shù)要求較高。另外，由于移植物的質(zhì)量參差不齊和宿主小鼠體內(nèi)缺乏與銀屑病患者相似的內(nèi)環(huán)境（如缺乏銀屑病相關(guān)細胞因子的高表達），也可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差，這些局限性均限制了異種移植模型在銀屑病研究中的廣泛應(yīng)用。

4 中醫(yī)特定證型動物模型

隨著銀屑病的中醫(yī)藥治療研究發(fā)展，中醫(yī)研究者通過控制豚鼠或小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度、飲食等，配合喂服中藥、外用普萘洛爾等，構(gòu)建出可模擬某一特定證型銀屑病的動物模型，根據(jù)其辨證分型分為血瘀型[39]、脾虛型[40]、濕熱型[41]等。

中醫(yī)特定證型動物模型在出現(xiàn)銀屑病樣皮損的基礎(chǔ)上，還會出現(xiàn)與相應(yīng)證型銀屑病患者相似的伴隨癥狀，如血瘀型動物模型伴隨體質(zhì)量減輕、膚色變暗等[39]，脾虛型動物模型伴隨少食、活動減少等[40]，濕熱型動物模型伴有嗜睡、肛溫升高等[41]，這些動物模型能較好的模擬銀屑病患者的整體狀態(tài)，為銀屑病中醫(yī)藥治療的機制、藥效學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。但因銀屑病中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究者相對較少，研究平臺暫局限于國內(nèi)，缺乏國際認(rèn)可，限制了其廣泛應(yīng)用。

5 總結(jié)

人類與模型動物之間有著顯著的細胞學(xué)、解剖學(xué)差異，兩者的免疫系統(tǒng)也有所不同，如小鼠T淋巴細胞上缺乏MHCⅡ類分子、具有人類所沒有的CD8+樹突狀細胞等[42]。此外模式小鼠的近親繁殖方式，使其缺乏人類的遺傳多樣性。這些種間差異的存在，提醒研究者在小鼠中觀察到的疾病表型或藥物療效可能并不表示在人類中也會有相同的結(jié)果。

各種模型構(gòu)建時，由于不同實驗室操作程序、不同模式動物的遺傳背景、動物飼養(yǎng)條件以及關(guān)鍵指標(biāo)評價體系的差異，造成了研究結(jié)果的混雜和偏差。如急性炎癥動物模型的構(gòu)建過程中，誘發(fā)藥物的濃度、劑量、處理時間、處理方式（外用或注射）等變量因素的差異，降低了研究結(jié)果的可重復(fù)性。因此需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序和評估體系，并加入適當(dāng)?shù)尿炞C研究。比如對建模過程的每一步操作進行量化，評估組織學(xué)特征時采取客觀治療（如測量表皮厚度），將研究結(jié)果在其他類型的動物模型上重復(fù)驗證，或采用已知有效的治療藥物（如CsA、TNF-α抑制劑）來幫助驗證等。

現(xiàn)有的銀屑病動物模型在銀屑病研究中發(fā)揮了必不可少的作用，極大的促進了對銀屑病發(fā)病機制的探索及開發(fā)新的治療藥物。盡管現(xiàn)有的動物模型有很多優(yōu)點，仍然沒有一種模型能完全模擬人類銀屑病的全部特征，研究者須根據(jù)課題設(shè)計、實驗經(jīng)費、研究平臺等因素合理選擇動物模型。