孔繁強(qiáng)，周樹民，張偉，陳松

腺苷（adenosine）為三磷酸腺苷（ATP）的代謝產(chǎn)物，部分研究認(rèn)為其對機(jī)體有免疫調(diào)節(jié)作用［1-2］。細(xì)胞損傷或缺氧時(shí)會(huì)大量釋放ATP到細(xì)胞外，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)的進(jìn)展［3］；位于細(xì)胞膜上的2種磷酸酶CD39和CD73可迅速轉(zhuǎn)化ATP為腺苷［4-5］。腺苷與其受體（adenosine receptors，ARs）相結(jié)合，可發(fā)揮局部免疫調(diào)節(jié)作用［6-7］。筆者此前研究顯示，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞是眼底組織中唯一高表達(dá)CD73的細(xì)胞，提示RPE在產(chǎn)生和利用腺苷上具有重要的作用［8］。ARs系統(tǒng)由ARA1、ARA2A、ARA2B及ARA3這4種亞型組成，它們在不同組織、細(xì)胞中的表達(dá)、分布及對腺苷的親和力顯著不同［9-10］。而這些不同亞型的ARs在功能上也截然不同。因此，了解不同種類的細(xì)胞是通過何種AR來利用腺苷是研究腺苷局部免疫調(diào)節(jié)作用的前提。本文旨在探討ARPE-19細(xì)胞中高親和力的腺苷受體亞型及其潛在功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人ARPE-19細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫；RNA提取試劑Trizol、人單核細(xì)胞趨化因子1（MCP-1）及C-X-C配體 10（CXCL10/IP-10）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒購自Invitrogen公司；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）的ELISA試劑盒購自R&D公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑及定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；小鼠抗人ARA1、ARA2A、ARA2B、ARA3單克隆抗體購自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG購自武漢博士德公司；放射性H3標(biāo)記的腺苷（H3-adenosine）購自北京原子能研究所；ARA1拮抗劑DPCPX、ARA2A拮抗劑SCH58261、ARA2B拮抗劑MRS1754、ARA3拮抗劑MRS1220及ARA1激動(dòng)劑CCPA購自美國Tocris公司。

1.2 腺苷受體在RPE中的表達(dá) 體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，至80%融合后取3孔細(xì)胞充分洗滌，加入Trizol試劑（1 mL/孔），室溫靜置5 min后刮除細(xì)胞，置于Trizol試劑中，參照試劑說明書進(jìn)行RNA提取。取1.0μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；取少量cDNA，real-time PCR測定4種腺苷受體基因的表達(dá)以gapdh為內(nèi)參照。上、下游引物序列見表1。另3孔細(xì)胞參照文獻(xiàn)［11］用于膜蛋白提取及Western blot檢測：取適量膜蛋白（1μg/樣本）行SDS-PAGE分離，半干法轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白條帶至硝酸纖維素膜（NC膜）上。剪取單個(gè)樣本的NC膜，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液封閉后，分別用抗ARA1、ARA2A、ARA2B及ARA3的抗體孵育，4℃過夜。充分洗滌后置于含HRP-兔抗小鼠IgG抗體的溶液中，室溫放置1 h。充分洗滌后將NC膜置于ECL發(fā)光底物中，室溫放置10 min，于暗盒中對X-ray膠片曝光、顯影及定影。

Tab.1 Primers used for real-time PCR表1 定量PCR引物序列

1.3 放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞至80%融合，按1×105個(gè)/mL密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞充分貼壁后加入不同劑量（0、5、10、30、100、200、400、800及 1 200 nmol/孔）H3-adenosine，每個(gè)劑量設(shè)立 3個(gè)復(fù)孔。37℃溫育1 h，抽吸轉(zhuǎn)移細(xì)胞至GF/C膜。先后以去離子水及95%乙醇充分洗滌、晾干后加入閃爍計(jì)數(shù)液，以液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)放射強(qiáng)度后計(jì)算出細(xì)胞所結(jié)合的腺苷量，繪制H3-adenosine結(jié)合曲線；Scat chart作圖計(jì)算出RPE對腺苷的最大結(jié)合容量（Bmax），以單位數(shù)量細(xì)胞（1×104細(xì)胞）理論上所能結(jié)合的最多腺苷量（單位：fmol）來表示。

1.4 不同亞型腺苷受體對RPE結(jié)合腺苷的貢獻(xiàn) 將ARPE-19細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，平均分為5組（A～E），每組含27孔細(xì)胞，分別給予1.3中所示的9種H3-adenosine濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。其中，A組為對照組；B～E組所有細(xì)胞分別給予ARA1拮抗劑DPCPX（終濃度50 nmol/L）、ARA2A 拮抗劑 SCH58261（100 nmol/L）、ARA2B 拮抗劑 MRS1754（100 nmol/L）及 ARA3 拮抗劑 MRS1220（5μmol/L），37℃溫育30 min。此后，按照1.3中所述方式計(jì)算每組細(xì)胞結(jié)合腺苷的Bmax（n=3）。

1.5 ARA1信號通路對ARPE-19分泌細(xì)胞因子及趨化因子的影響 體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞至80%融合，隨機(jī)分為對照RPE組（不予ARA1激動(dòng)劑）及CCPA干預(yù)RPE組（CCPA 100 nmol/L），每組6孔細(xì)胞。2組細(xì)胞均給予TNF-α 10μg/L及IFN-γ 1 000 U/mL聯(lián)合干預(yù)。48 h后收集上清，ELISA法檢測 IL-6、IL-10、TGF-β、MCP-1、IP-10 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2 組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APRE-19細(xì)胞中4種腺苷受體的表達(dá) 在體外培養(yǎng)的APRE-19細(xì)胞中既可以檢測到4種腺苷受體基因mRNA的表達(dá)，也可通過Western blot定性探測到這4種腺苷受體分子在APRE-19細(xì)胞膜上的存在，見圖1。

Fig.1 mRNA expression and membrane distribution of adenosine receptor subtypes in ARPE-19圖1 4種腺苷受體的mRNA表達(dá)及其在ARPE-19細(xì)胞膜上表達(dá)情況

2.2 RPE腺苷結(jié)合曲線及最大腺苷結(jié)合容量 RPE結(jié)合腺苷的飽和曲線顯示，隨著H3-adenosine加入劑量的增加，RPE對腺苷的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和；Scat chard作圖結(jié)果示RPE對腺苷的Bmax=2.04 fmol，見圖2。

Fig.2 Results of adenosine binding assay圖2 RPE腺苷結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同腺苷受體亞型對ARPE-19細(xì)胞結(jié)合腺苷的影響A～E組的Bmax（單位：fmol）分別為2.04±0.31、0.44±0.06、1.82±0.28、2.01±0.42 及 2.06±0.44（F=13.195，P＜0.01）。其中B組較其他各組Bmax均降低（P＜0.01），其他各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 細(xì)胞因子及趨化因子的ELISA結(jié)果比較 與對照RPE組比較，CCPA干預(yù)RPE組IL-6、MCP-1及IP-10的含量降低、IL-10的含量增加（P＜0.01）。2組TGF-β的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Effects of ARA1 signaling on RPE’s production of cytokines and chemokines表2 ARA1信號通路對RPE分泌細(xì)胞因子、趨化因子的影響（n=6，ng/L，±s）

Tab.2 Effects of ARA1 signaling on RPE’s production of cytokines and chemokines表2 ARA1信號通路對RPE分泌細(xì)胞因子、趨化因子的影響（n=6，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01

3 討論

腺苷及其受體構(gòu)成了非常復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在腫瘤免疫及炎癥免疫中均具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值［12］。該系統(tǒng)的復(fù)雜性表現(xiàn)在多個(gè)方面，如受體多樣性、分布廣泛性［13-14］及表達(dá)高度可變性［15］。正是基于腺苷-腺苷受體系統(tǒng)的復(fù)雜性，本文對其進(jìn)行研究時(shí)只能由單一細(xì)胞或單一組織入手再逐漸展開。本研究中real-time PCR及Western blot結(jié)果證實(shí)，4種腺苷受體亞型在ARPE-19細(xì)胞中均有表達(dá)。但是，受體的表達(dá)往往會(huì)受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)節(jié)，即某一強(qiáng)烈的受體信號可以反饋性抑制該受體的表達(dá)，導(dǎo)致受體的表達(dá)水平及其功能可能不是正相關(guān)，甚至是負(fù)相關(guān)的［16］。與受體的表達(dá)水平不同，受體對配體的結(jié)合情況與其功能多是正相關(guān)的［17］，因此，在研究受體表達(dá)的同時(shí)也要研究其配體結(jié)合情況。不同腺苷受體亞型對RPE結(jié)合腺苷的影響結(jié)果顯示，ARA1拮抗劑干預(yù)組較其他各組Bmax均降低，而其他各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ARA1是ARPE-19細(xì)胞中結(jié)合腺苷能力最強(qiáng)的受體亞型。研究顯示，以TNF-α及IFN-γ聯(lián)合干預(yù)的方式可充分激活A(yù)RPE-19細(xì)胞，使其大量分泌細(xì)胞因子及趨化因子［18］。本研究顯示，在TNF-α及IFN-γ聯(lián)合干預(yù)的ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TGF-β及趨化因子MCP-1、IP-10的存在，給予ARA1的激動(dòng)劑可顯著性抑制ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生 MCP-1、IP-10、IL-6這些促炎因子，而促進(jìn)抑炎因子IL-10的產(chǎn)生，提示ARA1通路與RPE細(xì)胞的免疫抑制功能密切相關(guān)。

綜上所述，4種腺苷受體亞型在ARPE-19細(xì)胞中均有表達(dá)，放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析顯示ARA1在ARPE-19細(xì)胞中具有相對較強(qiáng)的腺苷結(jié)合能力，該受體信號介導(dǎo)潛在的免疫抑制功能。

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