徐 瀚， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蔣天鵬， 宋 杰， 李 興

原發(fā)性肝癌是世界上最常見癌癥之一，死亡率位居癌癥死亡第2［1］。據(jù)2000年癌癥發(fā)病率報(bào)告，原發(fā)性肝癌在女性最常見惡性腫瘤中排名第8，在男性中名列第5［2］。因此，亟需盡快尋找一種針對(duì)肝癌的新治療方法及新治療靶點(diǎn)。目前對(duì)肝癌的治療策略包括傳統(tǒng)外科切除術(shù)［3］、細(xì)胞生物治療［4-5］、介入治療［6-7］、局部放療［8］、傳統(tǒng)化療［9］、中藥治療［10］及分子靶向藥物治療等。索拉非尼是目前唯一被我國(guó)及歐美多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)應(yīng)用于中晚期肝癌治療的分子靶向藥物，其通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，達(dá)到抑制肝癌組織新生血管及微血管生成目的［11］。 B7 蛋白家族包括 B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4，它們是一組與T細(xì)胞和B細(xì)胞活化及免疫功能有關(guān)的共刺激分子，被廣泛應(yīng)用于自身免疫疾病和癌癥治療［12-13］。本研究旨在以免疫印跡法（western blot，WB）觀察不同人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、 SMMC-7721、 MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）和正常人肝細(xì)胞株（HL-7702）蛋白表達(dá)，在其中篩選出B7-H3和B7-H4蛋白高表達(dá)細(xì)胞株并應(yīng)用索拉非尼，WB和溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）比色法檢測(cè)B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)，了解索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株的抑制作用及B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)是否常見，從而為肝癌預(yù)防和治療提供一候選新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)采用10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基 （HyClone，Logan，Utah，USA）和 DMEM 培 養(yǎng) 基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；抗 β-肌動(dòng)蛋白、B7-H3蛋白、B7-H4蛋白（一抗）及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（Sigma-Aldrich，Taufkirchen， Germany）；索 拉 非 尼 原 粉 藥 劑 （LKT Laboratories，St Paul，Minnesota，USA）；增強(qiáng)型二辛可酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime，Haimen，China）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株包括 HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6（美國(guó)菌種保藏中心 ATCC，Manassas，VA，USA）； 正常人肝細(xì)胞株為 HL-7702（ATCC， Manassas，VA，USA）。所有細(xì)胞均在37℃、5%二氧化碳和95%空氣環(huán)境中置于含10%胎牛血清并加入100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 索拉非尼抑制人肝癌細(xì)胞株測(cè)定

采用MTT比色法評(píng)價(jià)索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝 癌 細(xì)胞株的抗增殖活性作用。將不同人肝癌細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別給細(xì)胞加入0（對(duì)照）、1.25、2.5、5、10、15、20、40 μmol/L 劑量索拉非尼，48 h后混合MTT并再培養(yǎng)3 h，最后用微板讀數(shù)器（Perkin-Elmer，USA）在 570 nm 處檢測(cè)光密度（OD）。以公式抑制率（%）＝（OD對(duì)照－OD處理）/OD對(duì)照×100%［14］計(jì)算索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株抑制率。

1.4 WB檢測(cè)

對(duì) HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6、HL-7702 細(xì)胞株，分別以 0（對(duì)照）、5、10、20 μmol/L 劑量索拉非尼進(jìn)行處理，48 h后用增強(qiáng)型BCA蛋白測(cè)定試劑盒分別提取并測(cè)定以上細(xì)胞株中總蛋白濃度；采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）分離每個(gè)細(xì)胞株約30μg總蛋白，然后移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗β-肌動(dòng)蛋白、B7-H3、B7-H4蛋白等一抗，隨后偶聯(lián)山羊抗兔/HRP孵育，抗β-肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)負(fù)荷。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件（IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析后再以事后分析（Dunnet t檢驗(yàn)）進(jìn)一步比較不同組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)

WB法檢測(cè)顯示，所有人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)與正常人肝細(xì)胞株（HL-7702）相比，均顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖 1。

2.2 索拉非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞株的抑制作用

在B7-H3和B7-H4蛋白高表達(dá)的所有肝癌細(xì)胞株中選擇最為明顯的 Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等5種肝癌細(xì)胞株，探討索拉非尼對(duì)其表達(dá)的影響。在此實(shí)驗(yàn)之前，先用MTT比色法測(cè)定索拉非尼對(duì)這些人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性，以確定索拉非尼對(duì)這些肝癌細(xì)胞株有抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索拉非尼對(duì)上述5種肝癌細(xì)胞株均具有抑制作用，它們的半抑制濃度（IC50）值分別為14.56、9.14、9.46、17.21、9.29 μmol/L，見圖 2。

圖1 B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中表達(dá)

圖2 索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株抑制率

2.3 索拉非尼對(duì)B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)的影響

分別以5、10、20μmol/L劑量索拉非尼處理不同人肝癌細(xì)胞株（Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6）48 h后WB檢測(cè)顯示，不同人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯下調(diào)（P＜0.01），見圖 3、4。

圖3 索拉非尼對(duì)MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6中B7-H3蛋白表達(dá)影響

圖4 索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H中B7-H4蛋白表達(dá)影響

3 討論

免疫應(yīng)答缺陷可能有助于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中通常起著較為重要的作用，其中共刺激配體CD80和CD86對(duì)機(jī)體啟動(dòng)和維持免疫反應(yīng)密切相關(guān)，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失被認(rèn)為是腫瘤免疫逃逸的主要原因之一［15］。誘導(dǎo)抑制性因子如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4，CD152）和程序性細(xì)胞死亡分子-1（PD-1，CD279）在免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中表達(dá)并與抑制性因子配體結(jié)合，往往能夠參與腫瘤發(fā)?。?6］。如今阻斷抑制性輔助因子間相互作用已成功地應(yīng)用于腫瘤治療［17］，阻斷免疫細(xì)胞中抑制性輔助因子及腫瘤細(xì)胞中抑制性輔助因子配體表達(dá)，可能是防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要方法。

B7-H4和B7-H3是B7蛋白家族中抑制性輔助因子配體，與活化T細(xì)胞免疫功能有關(guān)［18-19］。Northern印跡法測(cè)定發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在胸腺、肺、脾臟轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［20］，B7-H3蛋白廣泛在淋巴器官、肝臟、睪丸、子宮、肺、骨骼肌等轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［21］。 B7-H4和B7-H3蛋白似乎只在細(xì)胞翻譯水平受限［22］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)B7-H4和B7-H3蛋白在非小細(xì)胞肺癌中有表達(dá)［23］，也有研究報(bào)道B7-H4蛋白在人肝癌細(xì)胞株 BEL-7404 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［24］。

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，目前已廣泛應(yīng)用于肝癌治療［25］，其一方面能通過阻斷RAF/MEK/RAK等信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，另一方面通過抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）受體及VEGF因子抑制腫瘤血管生成，具雙重抗腫瘤作用。早在2008年，歐美國(guó)家便完成了索拉非尼SHARPⅢ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示索拉非尼可使晚期肝癌患者中位生存期延長(zhǎng)44%、中位疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP）延長(zhǎng)74%、死亡風(fēng)險(xiǎn)降低31%［26］。以中國(guó)為主的亞太地區(qū)2009年完成OrientalⅢ期臨床試驗(yàn)，也顯示出與歐美國(guó)家相近的結(jié)果［27］。

然而，目前尙不清楚不同人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)情況及索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用。本研究結(jié)果顯示，B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、 BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）中表達(dá)，與正常人肝細(xì)胞株HL-7702相比，均明顯上調(diào)（P＜0.01）；WB法和MTT比色法檢測(cè)顯示索拉非尼通過抑制B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)對(duì) Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等人肝癌細(xì)胞株產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)；索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝癌細(xì)胞株均有細(xì)胞毒活性，其 IC50值分別為 14.56、9.14、9.46、17.21、9.29μmol/L；與對(duì)照組相比，在分別加入 5、10、20μmol/L等不同劑量索拉非尼48 h后，Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 等人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著下降（P＜0.01）。B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)常見，因此認(rèn)為其可能影響腫瘤免疫逃逸，而降低B7-H3和B7-H4蛋白在肝癌組織中表達(dá)則可能是預(yù)防和治療肝癌的候選靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中均過表達(dá)，但其與不同類型肝癌之間的關(guān)系尚需更深入研究，以達(dá)到個(gè)性化治療目的。

本研究結(jié)論認(rèn)為，B7-H3蛋白和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中通常過表達(dá)，可對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制造成影響，可能為肝癌預(yù)防和治療提供一個(gè)新靶點(diǎn)。

［1］ Umemura T， Ichijo T， Yoshizawa K， et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in Japan［J］.J Gastroenterol， 2009，44：102-107.

［2］ Bosch FX， Ribes J， Cleries R， et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis， 2005， 9： 191-211.

［3］ Akoad ME， Pom fret EA. Surgical resection and liver transplantation for hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis，2015，19： 381-399.

［4］ Xing SQ， Zhang CG， Yuan JF， et al.Adiponectin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma through differential modulation of thioredoxin proteins［J］.Biochem Pharmacol，2015，93： 221-231.

［5］ 宿敬存，趙 衛(wèi)，胡繼紅，等．TACE聯(lián)合RFA及自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞肝動(dòng)脈灌注治療原發(fā)性肝癌的臨床研究［J］．介入放射學(xué)雜志， 2017， 26： 24-29．

［6］ Habib A，Desai K，Hickey R，et al.Locoregional therapy of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis， 2015， 19： 401-420.

［7］ 劉 麗，卲天朋，楊 濤，等．經(jīng)動(dòng)脈灌注rAd-p53聯(lián)合TAE治療中晚期肝癌的療效觀察［J］．介入放射學(xué)雜志，2016，25：210-213．

［8］ Yang DS， Yoon WS， Lee JA， et al.The effectiveness of gadolinium MRI to improve target delineation for radiotherapy in hepatocellular carcinoma：a comparative study of rigid image registration techniques［J］.Phys Med， 2014， 30： 676-681.

［9］ Chen Y，Chen Y，Xiao D，et al.Low-dose chemotherapy of hepatocellular carcinoma through triggered-release from bilayerdecorated magnetoliposomes［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2014，116：452-458.

［10］ Hu Y，Wang S，Wu X，et al.Chinese herbal medicine-derived compounds for cancer therapy： a focus on hepatocellular carcinoma［J］.J Ethnopharmacol， 2013， 149： 601-612.

［11］ Lee JH，Chung YH，Kim JA，et al.Genetic predisposition of hand-foot skin reaction after sorafenib therapy in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Cancer， 2013， 119： 136-142.

［12］ Lei CX.B7 family-importantco-stimulatorymolecules［J］.Immunol J， 2002， 18： 54-57.

［13］ Salceda S， Tang T， Kmet M， et al.The immunomodulatory protein B7-H4 is over expressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation［J］.Exp Cell Res，2005，306：128-141.

［14］ Li W， Li DY， Wang HD， et al.Juglans regia hexane extract exerts antitumor effect，apoptosis induction and cell circle arrest in prostate cancer cells in vitro［J］.Trop JRharm Res， 2015，14：399-405.

［15］ Subauste CS， de Waal Malefyt R， Fuh F.Role of CD80（B7.1）and CD86（B7.2） in the immune response to an intracellular pathogen［J］.JImmunol， 1998， 160： 1831-1840.

［16］ Leibson PJ.The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptor［J］.Curr Opin Immunol， 2004， 16： 328-336.

［17］ Hodi FS， Mihm MC， Soiffer RJ， et al.Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients［J］.Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100：4712-4717.

［18］ Wang L， Liu LH， Shan BE.B7-H3： a promising target for tumor immunotherapy［J］.Immunol J， 2012， 28： 726-729.

［19］ Liu CZ， Yang KG， Cheng SS.B7-H4： a new negative regulator of T cell immunity［J］.Chem Life， 2009， 29： 794-798.

［20］ Sica GL，Choi IN，Zhu G，et al.B7-H4，amolecule of the B7 family， negatively regulates T cell immunity［J］.Immunity， 2003，18，849-861.

［21］ Chapoval AI， Ni J， Lau JS， et al.B7-H3： a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production ［J］.Nat Immunol， 2001， 2： 269-274.

［22］ Greenwald RJ， Freeman GJ， Sharpe AH.The B7 family revisited［J］.Annu Rev Immunol， 2005， 23： 515-548.

［23］ Sun Y，Wang Y，Zhao J，et al.B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer［J］.Lung Cancer， 2006， 53： 143-151.

［24］ Du ZD， Yu JP， Xu XP， et al.The expression of B7-H4 mRNA in HCC cell lines and the changes in BEL-7404 after using sorafenib［J］.JMed Res， 2011， 40： 30-33.

［25］ Bajetta E， Procopio G， Colombo A， et al.Sorafenib in hepatocellular carcinoma［J］.Clin Med Ther， 2009， 1： 277-287.

［26］ Llovet JM， Ricci S， Mazzaferro V， et al.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma［J］.N Eng Med， 2008， 359： 378-390.

［27］ Cheng AL， Kang YK， Chen Z， et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma：a phaseⅢ randomised，double-blind，placebo-controlled trial［J］.Lancet Oncol， 2009， 10： 25-34.