蔡小宇， 姜錦林， 單正軍， 卜元卿， 續(xù)衛(wèi)利

(1.南京信息工程大學(xué)江蘇省大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210044； 2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所國(guó)家環(huán)境保護(hù)農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042)

壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO)是以壬基酚和環(huán)氧乙烷在催化劑作用下經(jīng)縮合反應(yīng)形成的非離子表面活性劑。多樣的親水親油平衡值(HLB value)使其在化工產(chǎn)業(yè),尤其是洗滌劑和印染行業(yè)得到大量使用。它不僅具有良好的滲透性、乳化性和分散性,同時(shí)還能抗酸、抗堿、抗硬水、抗還原和抗氧化[1]。NPnEO進(jìn)入環(huán)境后其聚合鏈被打斷,形成保留1～2個(gè)環(huán)氧乙烷(EO)的壬基酚聚氧乙烯醚(NP1EO和NP2EO),這些代謝物可氧化成相應(yīng)的羧酸(NP1EC和NP2EC),最終轉(zhuǎn)化為壬基酚。壬基酚(NP)是一種被廣泛認(rèn)可的環(huán)境激素,通過(guò)模擬雌激素,對(duì)生物的性發(fā)育產(chǎn)生影響,干擾生物的內(nèi)分泌系統(tǒng),對(duì)生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用。同時(shí),NP能通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)不斷蓄積,因此,即使其排放濃度很低,也極具危害性。

NPnEO作為全球商用第2大類非離子表面活性劑,在使用過(guò)程中約60%會(huì)經(jīng)廢水排放進(jìn)入污水處理廠,最終進(jìn)入周圍的水體環(huán)境。馬興杰等[2]研究發(fā)現(xiàn)在污水處理廠進(jìn)、出水口都檢測(cè)到NPnEO和NP,其濃度水平存在潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。侯紹剛等[3]研究表明,NPnEO在黃河水體發(fā)生了有效降解,不同斷面層上都檢測(cè)到NPnEO的小分子降解產(chǎn)物,特別是持久性較強(qiáng)的NP在各個(gè)斷面都存在污染;同時(shí),在懸浮顆粒物和沉積物中也檢測(cè)到相應(yīng)的NP、NPlEO和NP2EO,與水體中含量相比其值都偏大,而懸浮顆粒物對(duì)NP、NP1EO和NP2EO的富集大于沉積物對(duì)它們的富集。吳偉等[4]的研究表明,NPnEO對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈各環(huán)節(jié)上的生物均有一定的急性毒性,其毒性由大到小依次為枝角類、魚(yú)類、藻類和微生物。國(guó)內(nèi)外有研究[5-6]表明,NP不僅具有內(nèi)分泌干擾作用,還具有很強(qiáng)的致畸、致癌、致突變效應(yīng)。

大型溞(Daphniamagna)是世界范圍內(nèi)分布最廣的甲殼綱枝角類無(wú)脊椎動(dòng)物,作為代表性的水生浮游動(dòng)物,在水生食物鏈中充當(dāng)著重要角色,是水生生態(tài)系統(tǒng)能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大型溞也是目前國(guó)內(nèi)外水生生物毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物,被廣泛應(yīng)用于水生生物毒性試驗(yàn)和評(píng)價(jià)[7]。筆者以大型溞為受試對(duì)象,研究了NPnEO原藥對(duì)大型溞的急性毒性和21 d慢性毒性效應(yīng),以期為保護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物

受試大型溞為筆者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的同一健康親溞孤雌生殖3代以上的幼溞,選取在24 h以內(nèi)出生,健康、活躍、體型勻稱的幼溞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)OECD 211準(zhǔn)則[8-9]的規(guī)定,大型溞需在指定配制的M4培養(yǎng)液中長(zhǎng)期育養(yǎng)[10],培養(yǎng)液中溶解氧飽和度保持在80%左右,pH值為7.8±0.2,培養(yǎng)液中溞密度為20只·L-1。育養(yǎng)環(huán)境條件:溫度為(20±2) ℃,光強(qiáng)為18 μE·m-2·s-1,t(光)∶t(暗)為16 h∶8 h[11]。育養(yǎng)過(guò)程中以綠藻和酵母作為餌料定期喂食,藻細(xì)胞投放密度應(yīng)控制在2.0×105～3.0×105mL-1。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液,同時(shí)將培養(yǎng)器皿清洗干凈[12]。

試驗(yàn)前,挑選體型大、懷卵多、活動(dòng)強(qiáng)的母溞置于1 L燒杯中,挑選數(shù)量為20～30只,用新鮮藻類喂食3周。試驗(yàn)采用這些母溞生產(chǎn)的2～5代幼溞,選取在6～24 h內(nèi)出生、健康活潑的幼溞用于毒性試驗(yàn),其重鉻酸鉀敏感度測(cè)定結(jié)果符合ISO標(biāo)準(zhǔn)[13]。

1.2 供試藥劑

壬基酚聚氧乙烯醚(NP40EO)來(lái)自阿拉丁公司,優(yōu)級(jí)純,純度w≥99.0%。外觀為無(wú)色或淡黃色液體,稍有苯酚氣味。分子式為(C2H4O)nC15H24O,CAS號(hào)為9016-45-9。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1急性毒性試驗(yàn)

參照OECD 202標(biāo)準(zhǔn)方法[14]進(jìn)行48 h急性毒性暴露試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,得出NP40EO對(duì)溞類100%活動(dòng)受抑制的最低濃度和全不抑制的最高濃度,確定正式試驗(yàn)的濃度范圍。以丙酮為助溶劑配制2.50、4.00、6.40、10.24、16.38和26.21 mg·L-16個(gè)處理組,并設(shè)置不加藥劑的空白對(duì)照組和助溶劑丙酮對(duì)照組〔w(丙酮)為0.1‰)〕。用w=0.1‰的丙酮溶液配制NP40EO母液,然后將其溶于M4培養(yǎng)液,配制不同的濃度處理組。每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)平行,在100 mL燒杯中裝入50 mL配制好的不同濃度藥液,每個(gè)燒杯中放入5只6～24 h溞齡的幼溞,分別于24和48 h后觀察并記錄活動(dòng)受抑制的幼溞數(shù)量。在急性毒性暴露過(guò)程中不飼喂餌料,不更換試液。

1.3.2慢性毒性試驗(yàn)

參照OECD 211標(biāo)準(zhǔn)方法[9]進(jìn)行21 d慢性毒性試驗(yàn)。根據(jù)急性毒性預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)獲得的NP40EO對(duì)大型溞的48 h半抑制濃度(EC50)值,設(shè)置6個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)平行,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和丙酮溶劑對(duì)照組〔w(丙酮)為0.1‰)〕。試驗(yàn)設(shè)置0.11、0.22、0.445、0.89、1.78和3.56 mg·L-16個(gè)處理組。試驗(yàn)前需打開(kāi)光照,調(diào)節(jié)室溫至20 ℃,將用w=0.1‰的丙酮溶液配制成的母液溶于M4培養(yǎng)液中,設(shè)置成不同濃度梯度處理組。試驗(yàn)時(shí),用量筒量取不同濃度藥液各50 mL,放入100 mL燒杯中,每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)平行,在每只燒杯中放入1只健康活潑的6～24 h溞齡幼溞,于t(光)∶t(暗)為16 h∶8 h、(20±2) ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)21 d,在容器的水面上使不超過(guò)15～20 μE·m-2·s-1強(qiáng)度的光照保持16 h。試驗(yàn)期間采用半靜態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)[15],每隔1 d更換1次試驗(yàn)溶液,以保證試驗(yàn)期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。在慢性毒性試驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)及時(shí)移除蛻下的殼和繁殖的幼溞,并每天記錄大型溞的生存、蛻殼、懷卵和繁殖情況。試驗(yàn)期間,每天喂食1種或多種新鮮藻細(xì)胞。在為期21 d的試驗(yàn)結(jié)束時(shí),使用體視鏡對(duì)存活大型溞拍照,并測(cè)量體長(zhǎng)(從頭盔至殼刺部)和記錄溞體形態(tài)變化,計(jì)算大型溞的平均首次蛻殼時(shí)間、平均蛻殼次數(shù)、平均首次產(chǎn)幼溞時(shí)間、平均產(chǎn)幼溞數(shù)量和產(chǎn)幼溞胎數(shù)及大型溞生長(zhǎng)21 d時(shí)的平均體長(zhǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

48 h EC50值是根據(jù)48 h急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件中的 Probit Analyze功能分析得到。根據(jù)慢性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù),用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析方法分析各種指標(biāo)與對(duì)照組的差異,采用Origin 8.0軟件分析各慢性毒性終點(diǎn)值的變化,得到最敏感指標(biāo)出現(xiàn)顯著性變化的暴露濃度,并計(jì)算各個(gè)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo)的無(wú)觀測(cè)效應(yīng)濃度(NOEC)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 NP40EO對(duì)大型溞的急性毒性

試驗(yàn)過(guò)程中試液溶解氧飽和度保持在80%左右,pH值約為7.5?？瞻讓?duì)照組大型溞生長(zhǎng)正常,無(wú)死亡現(xiàn)象。大型溞接觸NP40EO溶液后,受試溞在各濃度范圍條件下的活動(dòng)受到不同程度抑制,受抑制的溞個(gè)體腫脹肥大,呈白色,沉于水底。

NP40EO對(duì)大型溞的24和48 h EC50分別為>26.21 和14.23 mg·L-1,NP40EO對(duì)大型溞48 h EC50的95%置信限為10.632～19.04 mg·L-1。根據(jù)原國(guó)家環(huán)境保護(hù)局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[16]中關(guān)于農(nóng)藥對(duì)大型溞的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),NP40EO對(duì)溞類的毒性為低毒。

2.2 NP40EO對(duì)大型溞的慢性毒性

2.2.1NP40EO暴露對(duì)大型溞首次蛻殼時(shí)間的影響

由圖1可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),大型溞的首次蛻殼基本上都發(fā)生在第2天,個(gè)別大型溞在第2天以后初次蛻殼,當(dāng)ρ(NP40EO)為1.78 mg·L-1時(shí),大型溞初次蛻殼時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。

2.2.2NP40EO暴露對(duì)大型溞蛻殼次數(shù)的影響

圖2顯示,不同NP40EO濃度條件下大型溞平均蛻殼次數(shù)均不相同,空白對(duì)照組大型溞平均蛻殼次數(shù)最多,當(dāng)ρ(NP40EO)為0.445 mg·L-1時(shí),其平均蛻殼次數(shù)顯著下降(P<0.05),當(dāng)ρ(NP40EO)為0.89和1.78 mg·L-1時(shí),大型溞平均蛻殼次數(shù)極顯著下降(P<0.01),說(shuō)明NP40EO暴露能夠減少大型溞蛻殼次數(shù)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) *表示不同處理間首次蛻殼時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) *和**分別表示不同處理間首次蛻殼次數(shù)差異 顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3NP40EO暴露對(duì)大型溞首次產(chǎn)幼溞時(shí)間的影響

由圖3可知,大型溞首次產(chǎn)幼溞時(shí)間約為10 d,而當(dāng)ρ(NP40EO)為0.445和1.78 mg·L-1時(shí),首次產(chǎn)幼溞時(shí)間出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),可知NP40EO暴露對(duì)大型溞首次產(chǎn)幼溞時(shí)間存在一定影響。

2.2.4NP40EO暴露對(duì)大型溞存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)的影響

由圖4可知,NP40EO暴露能降低每只大型溞平均產(chǎn)幼溞數(shù)。當(dāng)ρ(NP40EO)為0.445～1.78 mg·L-1時(shí),大型溞產(chǎn)幼溞數(shù)顯著減少(P<0.05)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) *表示不同處理間首次產(chǎn)幼溞時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) 只統(tǒng)計(jì)存活至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大型溞所產(chǎn)幼溞數(shù)。

2.2.5NP40EO暴露對(duì)大型溞存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)的影響

由圖5可知,NP40EO暴露能降低每只大型溞平均產(chǎn)幼溞胎數(shù)。當(dāng)ρ(NP40EO)為0.22和1.78 mg·L-1時(shí),大型溞產(chǎn)幼溞胎數(shù)顯著減少(P<0.05),當(dāng)ρ(NP40EO)為0.445和0.89 mg·L-1時(shí),大型溞產(chǎn)幼溞胎數(shù)極顯著減少(P<0.01)。

2.2.6NP40EO暴露對(duì)大型溞存活個(gè)體平均體長(zhǎng)的影響

由圖6可知,NP40EO暴露能縮短每只大型溞平均體長(zhǎng)。當(dāng)ρ(NP40EO)為0.445～3.56 mg·L-1時(shí),NP40EO暴露21 d時(shí)大型溞體長(zhǎng)極顯著縮短(P<0.01)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) *和**分別表示不同處理間產(chǎn)幼溞胎數(shù)差異 顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

ρ(NP40EO)/(mg·L-1) **表示不同處理間大型溞體長(zhǎng)差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

通過(guò)NP40EO對(duì)大型溞的急性毒性試驗(yàn),筆者研究得到NP40EO對(duì)大型溞的急性毒性為低毒,其48 h EC50為14.23 mg·L-1,而吳偉等[4]的研究表明NP10EO對(duì)大型溞的急性毒性為中毒,其48 h EC50為8.2 mg·L-1,筆者研究結(jié)果與李秀環(huán)等[17]的相一致,后者的研究表明不同種類農(nóng)藥表面活性劑對(duì)大型溞急性毒性的結(jié)果表明烷基酚聚氧乙烯醚系列表面活性劑對(duì)大型溞的急性毒性屬中毒或低毒,當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度相同時(shí)，EO縮合數(shù)越大,毒性越低。HU等[18]研究了NP和NP10EO對(duì)多刺裸腹溞的復(fù)合毒性,結(jié)果表明NP10EO對(duì)多刺裸腹溞的48 h EC50為2.11 mg·L-1,所測(cè)得的毒性值比大型溞小,由于體型小,甲殼薄的溞體對(duì)污染物的敏感度更高,所以對(duì)于同一污染物裸腹溞比大型溞更為敏感。

NPnEO在環(huán)境中極易降解為NP,而NP具有很強(qiáng)的雌激素活性,筆者試驗(yàn)結(jié)果也表明NP40EO對(duì)大型溞具有毒害效應(yīng),對(duì)其存活、生長(zhǎng)和繁殖都具有影響,且隨著NP40EO濃度的增加,一些毒性效應(yīng)更為突出。國(guó)內(nèi)外已有許多研究表明NPnEO和NP可損傷動(dòng)物的生殖器官,TOLLEFSEN等[19]的研究表明NP會(huì)抑制大西洋鮭魚(yú)(Salmosalar)睪丸的發(fā)育,并誘導(dǎo)卵黃蛋白原的產(chǎn)生,促進(jìn)雌激素分泌。DOMENE等[20]的研究表明,NPnEO對(duì)土壤無(wú)脊椎動(dòng)物的繁殖具有顯著影響。ZHA等[21]研究表明,NP能夠引起生殖異常,并破壞許多動(dòng)物的生殖發(fā)育。筆者研究結(jié)果與之一致,NP40EO對(duì)大型溞的首次產(chǎn)幼溞時(shí)間、平均產(chǎn)幼溞數(shù)和平均產(chǎn)幼溞胎數(shù)都具有顯著影響,說(shuō)明NP40EO對(duì)大型溞的慢性毒性試驗(yàn)中,隨試驗(yàn)時(shí)間的增加,NP40EO不斷降解產(chǎn)生NP,從而對(duì)大型溞的生殖功能產(chǎn)生不利影響。LEBLANC[22]認(rèn)為,NP與蛻皮激素受體的結(jié)合使蛻皮激素信號(hào)的傳遞受到抑制,阻礙了甲殼動(dòng)物的蛻皮進(jìn)程,從而影響甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng),同時(shí)還推遲了繁殖生育時(shí)間,筆者研究結(jié)果與之完全一致,NP40EO的暴露減少了大型溞的平均蛻殼次數(shù)。

筆者研究表明,NP40EO對(duì)大型溞的急性毒性為低毒,同時(shí),慢性毒性的影響也尤為顯著。試驗(yàn)過(guò)程中,慢性毒性處理組母溞存在死亡現(xiàn)象,說(shuō)明NP40EO存在慢性致死性,在母溞產(chǎn)卵過(guò)程中,幾個(gè)處理組均有幼溞死亡或畸形現(xiàn)象發(fā)生,表明NP40EO對(duì)子代發(fā)育存在一定影響。因此,在自然環(huán)境中,如果大型溞暴露在筆者試驗(yàn)濃度條件下,其種群數(shù)量將會(huì)減少。由于NPnEO的降解產(chǎn)物是NP,而NP是造成溞類死亡和生長(zhǎng)抑制的主要因素,在環(huán)境中兩者又處于長(zhǎng)期共存狀態(tài),所以需要進(jìn)一步評(píng)估兩者聯(lián)合作用對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的危害[23]。同樣,正在廣泛使用的其他助劑類產(chǎn)品所引起的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也應(yīng)受到人們足夠的重視。

4 結(jié)論

NP40EO對(duì)大型溞的48 h EC50為14.23 mg·L-1,屬于低毒。NP40EO暴露對(duì)大型溞的首次蛻殼時(shí)間存在影響,同時(shí)對(duì)平均蛻殼次數(shù)產(chǎn)生顯著影響,并延遲大型溞首次產(chǎn)幼溞時(shí)間,減少每只大型溞平均產(chǎn)幼溞胎數(shù)和產(chǎn)幼溞數(shù),減緩大型溞的個(gè)體生長(zhǎng)。大型溞的平均產(chǎn)幼溞數(shù)、平均產(chǎn)幼溞胎數(shù)和個(gè)體體長(zhǎng)這3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NP40EO暴露很敏感,而首次產(chǎn)幼溞時(shí)間、平均蛻殼次數(shù)對(duì)NP40EO暴露比較敏感,首次蛻殼時(shí)間敏感度相對(duì)較差。因此,綜合考慮各項(xiàng)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo),NP40EO對(duì)大型溞的LOEC值為0.445 mg·L-1,NOEC值為0.11 mg·L-1。由于NPnEO在市場(chǎng)上的廣泛使用,雖然其對(duì)大型溞的急性毒性較低,但筆者研究表明NP40EO在較低濃度下便能顯著影響大型溞的各項(xiàng)慢性毒性終點(diǎn),因此,建議在使用前對(duì)其進(jìn)行環(huán)境生物影響風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。由于該物質(zhì)主要存在于各類廢水中,更應(yīng)廣泛關(guān)注其對(duì)水生生物的毒性,尤其要注意其對(duì)浮游甲殼類生物的影響。

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