傅云　李建民　王業(yè)秋等

[摘要]目的：研究甘草次酸對(duì)光老化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）的保護(hù)作用及NF-κB信號(hào)通路的影響。方法：用30mJ/cm²的UVB照射HaCaT細(xì)胞，建立光老化模型；用不同濃度（10^-7、10^-5、10^-5mol·L^-1）的甘草次酸處理光老化HaCaT細(xì)胞24h。MTT法檢測(cè)甘草次酸對(duì)細(xì)胞活性的影響；試劑盒法檢測(cè)各組細(xì)胞上清SOD、GSH活性及MDA含量；Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κBP5 0和NF-κBP6 5蛋白表達(dá)量。結(jié)果：模型組細(xì)胞與空白組細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.01）；GSH、SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P<0.01）；NF-κBP5 0、NF-κBP65蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。甘草次酸處理的HaCaT細(xì)胞與模型組細(xì)胞相比，甘草次酸組細(xì)胞增殖率顯著升高（P<0.01）；GSH、SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.01）；NF-κBP50、NF-κBP65蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：甘草次酸能顯著保護(hù)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光老化，其機(jī)制可能與其抑制氧化損傷，阻斷NF-κB信號(hào)通路，抑制NF-κBP50、NF-κBP65蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]甘草次酸；光老化；HaCaT細(xì)胞；NF-κB信號(hào)通路

[中圖分類(lèi)號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）08-0077-03

皮膚位于人體最外層，不僅具有排汗、防寒作用，而且還具有抵御外來(lái)刺激的作用，是人體第一道防御系統(tǒng)。內(nèi)源性老化是人體自然衰老，外源性老化主要是由于物理和化學(xué)因素誘發(fā)的，其中，uv誘導(dǎo)皮膚老化，稱(chēng)為光老化。近幾年來(lái)，皮膚光老化現(xiàn)象普遍增多的主要原因是環(huán)境污染，臭氧層阻擋UV的能力減弱，到達(dá)地球表面的UV逐漸增多。據(jù)報(bào)道，UVB是皮膚光老化主要誘發(fā)因素，長(zhǎng)期的UVB輻射將導(dǎo)致皮膚皺縮、無(wú)彈性、無(wú)光澤、色素沉著及惡性腫瘤發(fā)生。近幾年，越來(lái)越多人關(guān)注美容養(yǎng)護(hù)，于是，探索皮膚光老化發(fā)病機(jī)制及從中藥中尋找有效成分預(yù)防和治療皮膚光老化成為現(xiàn)代科研重點(diǎn)發(fā)展方向。

甘草為豆科甘草屬植物的根和根莖，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有清熱解毒、補(bǔ)脾和胃、緩急止痛、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等作用。甘草次酸作為甘草根莖中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗?jié)?、抗心律失常、調(diào)節(jié)免疫力等功效。人皮膚表層主要由角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）組成的，HaCaT細(xì)胞是UVB的靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用30mJ/cm²UVB照射HaCaT細(xì)胞，建立光老化模型，用不同濃度甘草次酸作用于光老化HaCaT細(xì)胞，探討甘草次酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用及NF-κB信號(hào)通路影響。

1材料和儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料：人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT（中喬新舟）；胎牛血清FBS（Hyclone公司，批號(hào)：NYB0614）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，批號(hào)：NZM1301）；雙抗（Hyclone公司，批號(hào)：20161230）；磷酸鹽緩沖液PBS（北京中山金橋有限公司，批號(hào)：20160509）；胰蛋白酶（Billab公司，批號(hào)：J120028）；四甲基噻唑藍(lán)MTT（Sigma公司，批號(hào)：021005）；二甲基亞砜DMSO（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20160716）；SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170522）；GSH試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170518）；MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170520）；RIPA細(xì)胞裂解液及PMSF蛋白酶抑制劑（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗人β-actin單克隆抗體（博奧森生物有限公司）；兔抗人NF-κBP50多克隆抗體（南京恩晶生物科技有限公司）；兔抗人NF-κBP65多克隆抗體（南京恩晶生物科技有限公司）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；甘草次酸，經(jīng)本校陳效忠副教授鑒定純度為正品（98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)ZL00380718）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器：生物潔凈工作臺(tái)（BCM-1000A型），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Olympus倒置顯微鏡（IX-71-21PH型），日本Olympus株式會(huì)社；二氧化碳培養(yǎng)箱（HF90型），上海智城分析儀器有限公司；酶標(biāo)儀（MK3型），上海熱電儀器有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TCL6G-C），上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-10C型電泳儀，北京六一儀器廠；Smart Chemi500型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 10%DMEM培養(yǎng)液的配制：DMEM培養(yǎng)基：PBS：P/S=89：10：1，混勻，4℃保存。

2.2藥物配制：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定甘草次酸濃度大于10^-5mol·L^-1時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生毒性，本實(shí)驗(yàn)將甘草次酸加入DMEM培養(yǎng)液中，配制成10^-5、10^-6、10^-7mool·L^-13個(gè)濃度，調(diào)至pH 7.0，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存待用。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，胰酶消化，離心，并使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×10⁴²個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，1×10⁶個(gè)/孔將細(xì)胞接種至6孔板，于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4 MTT法檢測(cè)甘草次酸對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響：96孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組、（10^-7、10^-6、10^-5mol·L^-1）甘草次酸組。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，每孔加200μl PBS，使用鋁箔紙將空白組覆蓋，用30mJ/cm²UVB照射模型組和甘草次酸組，照射完畢，棄去PBS，甘草次酸組加入不同梯度濃度的甘草次酸，模型組和空白組加入等量培養(yǎng)液，孵育24h后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl DM80，37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10min，在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。endprint

2.5試劑盒檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中GSH、SOD活性及MDA含量：6孔板細(xì)胞參照2.4方式建立光老化模型。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，收集6孔板中各組細(xì)胞，PBS沖洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF以99：1混勻，按照100μl/孔加入混合液，冰盒上靜置30min，4℃ 13200rpm的條件下離心15min，在冰盒上收集上清液于離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞中GSH、SOD活性及MDA含量。

2.6 Western Blot法檢測(cè)HaCaT中NF-κ BP50和NF-κ BP65蛋白表達(dá)量：收集6孔板中各組細(xì)胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，每孔加樣20μl，8DS-PAGE電泳60min，半干轉(zhuǎn)膜30min，室溫封閉2h，加入一抗孵育，4℃過(guò)夜，TBST洗膜三次，加二抗室溫孵育1h，TBST洗膜三次，加入ECL顯色，使用發(fā)光成像儀拍攝，利用Lane ID凝膠軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值，反映目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行分析，若P<0.05，則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1甘草次酸對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響：與空白組相比，模型組細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，10^-7、10^-6、10^-5mol·L。甘草次酸組細(xì)胞增殖率顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)表1。

3.2甘草次酸對(duì)HaCaT細(xì)胞中SOD、GSH及MDA活性的影響：見(jiàn)表2。模型組與空白組相比，模型組細(xì)胞中GSH、SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P<0.01）；甘草次酸組與模型組相比，不同濃度（10^-7、10^-6、10^-5mol·L^-1）甘草次酸組細(xì)胞中GSH、SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.01）。隨著濃度的增大，SOD、GSH活性逐漸升高，MDA含量逐漸降低。由此可知，10^-7、10^-6、10^-5mol·L^-2的甘草次酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用對(duì)甘草次酸的濃度有一定的依耐性。

3.3甘草次酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞中NF-κ BP50和NF κ BP65蛋白表達(dá)量的影響：如表3和圖1所示，模型組與空白組相比，模型組細(xì)胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；甘草次酸組與模型組相比，濃度為10^-7mol·L^-1的甘草次酸組細(xì)胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05，P<0.01），濃度為10 6mol·L^-1和濃度為10^-5mol·L^-1的甘草次酸組細(xì)胞中NF-κ BP50、NF-κ BP65蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.01）。由此可知，不同濃度10^-7、10^-6、10^-5mol·L^-1的甘草次酸能夠顯著的降低光老化細(xì)胞中NF-κ BP50和NF-κBP65蛋白的表達(dá)。

4討論

目前關(guān)于UVB誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞光老化機(jī)制的探索，除了炎癥因子的研究，體內(nèi)的信號(hào)通路參與也是研究的重點(diǎn)。近年來(lái)研究顯示，NF-κB信號(hào)通路參與了UV誘導(dǎo)皮膚炎癥因子分泌過(guò)程。UVB輻射HaCaT細(xì)胞，導(dǎo)致多種炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1α、IL-β、IL-8、IL-6、IL-10等，進(jìn)而引起皮膚光老化。UV誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子不僅可以作用于細(xì)胞因子受體，也可以激活A(yù)P 1及NF-κB通路，促進(jìn)光老化產(chǎn)生。NF-κB主要是NF-κ BP50、NF-κ BP65組成的二聚體。無(wú)刺激的條件下，NF-κB（P50和P65）與IκB蛋白結(jié)合，保持無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)UVB照射HaCaT時(shí)，刺激I-κB分離，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)下游基因的表達(dá)，同時(shí)，也會(huì)激活相關(guān)細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子以及相關(guān)蛋白酶的表達(dá)等。另外，UVB誘導(dǎo)光老化角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)程中，NF-κB信號(hào)通路參與IL-1、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，IL-1、TNF-α又可以激活NF-κB信號(hào)通路，形成一個(gè)惡性循環(huán)系統(tǒng)。因此，NF-κB不僅對(duì)維持正常表皮細(xì)胞起重要作用，還參與免疫及炎癥等相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，也參與了UV誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB可以顯著升高光老化HaCaT細(xì)胞中NF-κ BP50/NF-κ BP65蛋白的表達(dá)，但加入甘草次酸后可顯著降低了NF-κBP50、NF-κBP65蛋白的表達(dá)，由此可知，甘草次酸可通過(guò)提高GSH、SOD活性和降低MDA含量，減輕氧化損傷，抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而減少皮膚光老化的發(fā)生。endprint