潘展硯　陳佳　胡婷婷等

[摘要]目的：探索正常皮膚、目光性角化（AK）、鮑溫病和皮膚鱗狀細胞癌（SCC）組織中芳香烴受體通路相關(guān)蛋白AHR及CYP1A1的表達。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測15例正常皮膚，10例AK，10例鮑溫病以及20例皮膚SCC中AHR及CYP1A1蛋白表達情況。結(jié)果：AHR在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中表達于細胞漿和細胞核，陽性率分別為33%，100%，80%，65%；AHR在細胞核表達中陽性率分別為20%，70%，60%，50%；CYP1A1在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中表達于細胞漿，陽性率分別為20%，20%，20%，15%。結(jié)論：AHR的高表達和激活與皮膚SCC的發(fā)生有關(guān)，值得進一步研究其在皮膚腫瘤中的作用。

[關(guān)鍵詞]芳香烴受體；AK；鮑溫??；鱗狀細胞癌

[中圖分類號]R739.5 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）08-0080-03

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR），又稱為二噁英受體，是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活外源性代謝酶細胞色素P450家族（CYP），調(diào)節(jié)多種環(huán)境污染物如二噁英（TCDD）和多環(huán)芳烴類（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）在細胞內(nèi)的代謝過程。AHR參與環(huán)境污染物的代謝，會導(dǎo)致某些致癌中間代謝物的產(chǎn)生，從而引起腫瘤的產(chǎn)生。最新研究顯示，AHR可以被中波紫外線激活，并對細胞增殖、凋亡和炎癥因子產(chǎn)生影響，從而參與日光性皮膚腫瘤的發(fā)生。

雖然有細胞和動物研究推測AHR的表達和激活與皮膚腫瘤的形成有關(guān)，但AHR與臨床皮膚腫瘤的相關(guān)性研究還未見相關(guān)報道。本研究擬通過免疫組織化學(xué)技術(shù)分析AHR在正常皮膚、日光性角化?。╝ctinic keratosis，AK）、鮑溫?。˙owen Disease）、皮膚鱗狀細胞癌（Squmous cell carcinoma，SCC）的表達差異。

1材料和方法

1.1標(biāo)本來源：標(biāo)本來自于上海市皮膚性病醫(yī)院2013年1月2015年7月活檢存檔蠟塊，其中正常皮膚15例，AK標(biāo)本10例，鮑溫病10例，皮膚SCC20例。以上標(biāo)本均經(jīng)病理檢查及免疫組織化學(xué)檢查證實，且所有病例病理檢查均未經(jīng)過化療、放療及其他免疫治療。

1.2試劑：兔抗人AHR抗體和CYP1A1抗體購買自美國Santa Cruz Biotechnology公司；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒（鼠/兔）、粉劑型檸檬酸抗原修復(fù)液、粉劑型PBS磷酸鹽緩沖液購自福建邁新公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色：將所有標(biāo)本以4μm厚度連續(xù)切片，將組織切片常規(guī)脫蠟。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照；用試劑公司提供的已知陽性切片作為陽性對照。所有標(biāo)本用檸檬酸修復(fù)抗原，滴加一抗，37℃孵育60mim PBS緩沖液沖洗3min×3次；滴加二抗，室溫孵育30min，PBS緩沖液沖洗3min×3次；滴加新鮮配制的DAB顯色，鏡下控制顯色時間，及時終止顯色；依次蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，風(fēng)干，樹脂封片。

1.4結(jié)果判定：染色結(jié)果判定以胞漿、細胞核現(xiàn)清晰的黃褐色至黃色顆粒者為陽性。按400倍視野陽性細胞百分值（0%：0分；1%～25%：1分；26%～50%：2分；>50%：3分）和細胞著色強度（陰性：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分）評分。兩分值相加，0～2分為陰性，3～6分為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)分析，正常皮膚的陽性率與三種皮膚腫瘤的陽性率比較采取2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 AHR在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中的表達測定結(jié)果：AHR在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中表達于細胞漿和細胞核，總陽性率分別為：33%，100%，80%，65%。AHR在三種皮膚腫瘤中表達顯著高于正常皮膚（X²=9.41，P<0.01）；AHR在AK中的表達高于皮膚SCC（X²=4.57，P<0.05）；AHR在細胞核表達中陽性率分別為：20%，70%，60%，50%（圖1），AHR在三種皮膚腫瘤細胞核表達陽性表達率顯著高于正常皮膚（X²=6.15，P<0.05）。見表1。

2.2 CYP1A1在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中的表達測定結(jié)果：CYP1A1在正常皮膚、AK、鮑溫病和皮膚SCC中表達于細胞漿，陽性率分別為20%，20%，20%，15%；CYP1A1在三種腫瘤表達的陽性率與正常皮膚無差異（X²=0.05，P>0.05）。見表1。

3討論

AHR及下游信號通路與皮膚腫瘤的發(fā)病相關(guān)。研究顯示環(huán)境污染物如PAHs，TCDD，苯并芘、二苯并咔唑（DBC）、煤焦油及香煙混合物等均是AHR強激活配體，它們在動物模型均可引發(fā)皮膚SCC。AHR作為皮膚環(huán)境污染物的受體在皮膚癌變的過程中發(fā)揮重要作用。AHR被激活后其下游細胞色素代謝酶（CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1等）隨后被激活，環(huán)境污染物經(jīng)過代謝后水溶性增加，在這過程中污染物的毒性可能增強，特別是芳香烴類的代謝物可以直接攻擊DNA形成突變。AHR與日光性皮膚腫瘤發(fā)生也有相關(guān)性。Fritsche等發(fā)現(xiàn)UVB照射角質(zhì)形成細胞后，細胞內(nèi)的色氨酸產(chǎn)生的光產(chǎn)物6甲?；胚岵3，2-b]咔唑（FICZ），F(xiàn)ICZ能夠激活A(yù)HR。AHR被UVB激活后能夠抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚角質(zhì)形成細胞的凋亡過程，在動物實驗中證實，AHR敲除的小鼠相比正常小鼠，同樣劑量的UVB長期照射后，皮膚SCC生成數(shù)量減少50%。但是AHR與臨床皮膚腫瘤的相關(guān)性研究尚未見相關(guān)報道。

本研究收集了臨床皮膚SCC皮損以及其兩種早期病變進行了研究。AK與日曬相關(guān)，是老年人群中發(fā)病率最高的皮膚腫瘤，也是典型的癌前病變。由AK發(fā)展生成的皮膚SCC惡性程度較高，容易早期轉(zhuǎn)移。鮑溫病是原位鱗狀細胞癌，轉(zhuǎn)變?yōu)槠つwSCC的幾率很高。AHR在AK組織和鮑溫病中的陽性率高達100%和80%，處于高表達狀態(tài)；AHR在這兩種皮膚腫瘤細胞核表達中陽性率為70%和60%，顯示AHR信號通路在這兩種皮膚腫瘤中處于激活狀態(tài)；AHR在AK組織中的表達高于皮膚SCC；這些結(jié)果提示AHR高表達和激活與皮膚SCC生成的起始事件相關(guān)。相關(guān)細胞學(xué)研究也表明，AHR的激活可以導(dǎo)致細胞膜FEGFR的異常激活，還與NF-κB信號通路的激活有關(guān)，提示了AHR參與皮膚細胞增殖和炎癥等腫瘤發(fā)生的早期事件。

本研究顯示AHR下游經(jīng)典基因CYP1A1的陽性率在正常皮膚和三種皮膚腫瘤細胞之間未有明顯差異，而AHR在三種皮膚腫瘤細胞核內(nèi)的表達均明顯高于正常皮膚，顯示AHR處于激活狀態(tài)。這提示，AHR在皮膚腫瘤細胞中被激活后沒有啟動經(jīng)典的TCDD/AHR/ARNT/CYP1A1途徑，而是啟動了不依賴ARNT的蛋白磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其下游激活的靶位基因可能包括β-連環(huán)蛋白、原癌基因c-Myc、表皮生長因子受體等。這條信號通路下游可能與細胞增殖和分化、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)，需要進一步探討，以期為皮膚腫瘤的發(fā)病研究帶來新的突破。endprint