不同培養(yǎng)條件對奶牛體外受精效果的影響

林峰　宋歡　黃承俊

摘要：為了提高奶牛體外受精效果，研究了體外成熟卵母細(xì)胞在IVF-100、BO、TALP 3種體外受精液中的受精效果，同時比較了裸卵（NOs）與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）對受精效果的影響。結(jié)果顯示，體外成熟卵母細(xì)胞在受精液IVF-100中的卵裂率顯著高于BO液（P<0.05），而TALP液中的卵裂率與IVF-100和BO液的差異都不顯著（P>0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），但差異不顯著（P>0.05）；NOs的囊胚率極顯著低于COCs（P<0.01）。不同受精液及有無卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞的體外受精效果有明顯的影響。

關(guān)鍵詞：奶牛；卵母細(xì)胞；體外受精；卵裂率；囊胚率

中圖分類號： S823.9+13文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0137-02

隨著配子與胚胎生物技術(shù)的研究與應(yīng)用，對胚胎的需求量越來越大。超數(shù)排卵和胚胎移植的合理化應(yīng)用雖能成倍提高優(yōu)良母畜的繁殖率，但所獲得的胚胎數(shù)量有限。為了解決這個問題，近年來國內(nèi)外對奶牛卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)進(jìn)行了大量的研究。保國俊等通過體外受精技術(shù)提供了更多數(shù)量、更低成本的胚胎[1-2]，IVF技術(shù)是對品種優(yōu)良的公畜、母畜發(fā)揮出超常繁殖能力的一種應(yīng)用。

由于體外受精技術(shù)操作環(huán)節(jié)十分復(fù)雜，影響結(jié)果因素較多，且卵母細(xì)胞在體外的生長繁殖對生存環(huán)境要求特別高，易導(dǎo)致試驗體系不夠穩(wěn)定，從而對試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性造成很大影響[3-4]。本研究通過對比3種受精液對卵母細(xì)胞體外受精效果的研究，以其為基礎(chǔ)來研制出更好的受精液，進(jìn)而加快我國奶牛業(yè)的發(fā)展，提高經(jīng)濟(jì)效益。裸卵和卵丘卵母細(xì)胞體外受精后，都可以發(fā)育到囊胚階段，但裸卵的囊胚率顯著低于卵丘卵母細(xì)胞的囊胚率。通過對比2種卵母細(xì)胞的囊胚率，對體外受精時卵母細(xì)胞的篩選起著重要作用。本試驗就不同受精液、不同形態(tài)的卵子對奶牛成熟卵母細(xì)胞體外受精能力的影響進(jìn)行了研究，皆在為優(yōu)化奶牛體外受精提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1卵巢的采集與保存

本試驗所用奶牛卵巢來自河南省鄭州市郊個體屠宰場。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪組織，然后用加有雙抗的生理鹽水沖洗5～6次，保存在裝有37 ℃左右、加有雙抗的滅菌生理鹽水中，于2～3 h內(nèi)帶回實驗室。

1.1.2主要試劑

胎牛血清（FBS）（Biotech，P40-47500）；肝素鈉（Sigma，H3149-25KU）；石蠟油（Sigma）；TCM-199（Gibco）；NaCl（Sigma，S-5886）；KCl（Sigma，P-5405）；NaH2CO3（Sigma，S-5761）；NaH2PO4（Sigma，RDD007）；CaCl2·2H2O（Sigma，C-5080）。

1.2試驗方法

抽吸法：用無菌紗布將卵巢表面擦干，抽吸法吸取直徑 2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培養(yǎng)皿中，挑選裸卵、半裸卵及具有3層及其以上卵丘的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs）用于試驗。

1.3卵母細(xì)胞分級標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)包被卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞完整性、卵丘細(xì)胞層數(shù)以及卵母細(xì)胞的胞質(zhì)均勻性將卵母細(xì)胞分為4級：A級，卵丘細(xì)胞3層以上，胞質(zhì)均勻；B級，1～2層卵丘細(xì)胞，胞質(zhì)均勻；C級，裸卵，卵丘細(xì)胞不完整；D級是死亡或退化的卵母細(xì)胞。A、B級卵母細(xì)胞為可用卵母細(xì)胞。

1.4卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

將收集的卵母細(xì)胞用成熟液洗3遍，然后每40～60個移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空氣、38.5 ℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24 h。若卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)則用微滴法（100 μL），以排出第一極體為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[5]。

1.5卵母細(xì)胞的體外受精

受精液為IVF-100或BO液時運用直接離心法對精子進(jìn)行洗滌，即用6 mL洗精液稀釋解凍的精液并于2 000 r/min下離心7 min，棄去上清液，重復(fù)1次后用受精液稀釋精子，密度為1×106～6×106 個/mL，然后放入CO2培養(yǎng)箱中備用。受精液為TALP液時則用上浮法對精子進(jìn)行30～60 min的孵化，然后再離心洗滌。將23～24 h成熟的卵母細(xì)胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管將卵丘細(xì)胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蠟油的50 μL受精微滴中，加入50 μL精液后于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精。IVF-100受精時間為6 h，BO液受精時間為8 h，TALP液受精時間為18 h。

1.6卵母細(xì)胞體外成熟判定

卵丘-卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22～24 h后，主要通過在顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)來判斷卵母細(xì)胞是否成熟。正常成熟的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均勻，沒有空泡，其周圍的卵丘細(xì)胞發(fā)生擴展。卵丘細(xì)胞擴展常用作判斷卵母細(xì)胞體外成熟的特征。將培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞放入含有0.1%透明質(zhì)酸酶的成熟培養(yǎng)液中，在CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min后用吸胚管輕輕吹打以脫去卵丘細(xì)胞，將裸卵在體視顯微鏡下鏡檢，含有第一極體的判為成熟[6]。若卵周隙明顯變大，細(xì)胞質(zhì)中有空泡出現(xiàn)，判定已經(jīng)開始退化。

1.7統(tǒng)計分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同受精液對受精卵卵裂的效果

將經(jīng)體外成熟的卵母細(xì)胞隨機移入3種不同的受精微滴（即TVF-100、BO液和TALP液）中受精。受精后進(jìn)行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起48 h對各組的卵裂情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。從表1可以看出，用IVF-100作為受精液，其體外受精48 h后的卵裂率顯著高于BO液的卵裂率（P<0.05），而以TALP液作為受精液，其卵裂率與其他組無差異。說明不同的受精液對卵裂有顯著影響，從卵母細(xì)胞卵裂率來看，IVF-100作為受精液顯著優(yōu)于BO液和TALP液2種受精液。endprint

2.2卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞受精及受精后胚胎體外發(fā)育的效果

選取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母細(xì)胞（COCs）進(jìn)行體外受精，并用IVF-100受精液稀釋精子，受精后進(jìn)行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起48 h對各組的卵裂情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。從表2可以看出，雖然COCs的卵裂率高于自然裸卵，但差異并不顯著（P>0.05），而其囊胚率極顯著高于COCs的（P<0.01）。表明卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞受精后體外發(fā)育的影響要遠(yuǎn)高于對卵母細(xì)胞受精的影響。

3討論

3.1不同受精液對奶牛卵母細(xì)胞體外受精的影響

影響卵母細(xì)胞體外受精的因素很多[6]，受精液及其成分以及卵母細(xì)胞的形態(tài)是主要因素。本試驗對比了3種不同的受精液對卵母細(xì)胞體外受精效果的影響，BO液和TALP液為目前經(jīng)典的2種受精液，這些溶液相對比較簡單，主要成分是無機鹽離子，不含復(fù)雜的氨基酸和維生素等成分。IVF-100為商品化的受精液，基礎(chǔ)液為BO液，效果穩(wěn)定而且效率較高，對于成熟良好的卵母細(xì)胞受精率一般高達(dá)80%～90%。由于其價格較高，常用于活體取得的卵子體外受精或其他特殊卵子的體外受精試驗中[7]。試驗結(jié)果顯示，IVF-100作為受精液時的卵裂率顯著高于BO液的（P<0.05），雖然在數(shù)值上表現(xiàn)出高于TALP液的趨勢，但統(tǒng)計檢驗差異不顯著。同時TALP液與BO液的卵裂率也無明顯差異。不同受精液對試驗結(jié)果有著明顯的影響。這表明IVF-100在促進(jìn)受精卵的卵裂上的作用要強于BO液，同時也說明BO液作為體外受精液還存在巨大的改進(jìn)空間。BO液對精子的作用比較強烈，因而與受精卵共孵化的時間不能過長。相比之下TALP液對精子的作用就比較溫和些，與本試驗結(jié)果相同，許多試驗顯示其雖然在數(shù)值上有高于BO液的趨勢但統(tǒng)計結(jié)果無差異。而且一些試驗結(jié)果表明其對胚胎發(fā)育效果不如BO液[8-9]，由于這方面受受精時間、卵丘細(xì)胞、精子的洗滌等許多因素的制約，其機制仍有待探索。就總體而言，成熟良好的卵母細(xì)胞不管用于何種受精液，其受精卵的卵裂率都較高，但I(xiàn)VF-100對受精卵卵裂的促進(jìn)作用要強于其他受精液。IVP技術(shù)作為一個整體，各個環(huán)節(jié)精密相關(guān)，因而要想得到較多的可移植胚，一個相對較好的受精環(huán)節(jié)是必須的。

3.2有無卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞體外受精效果的影響

本研究在自然裸卵與COCs經(jīng)體外成熟后，對其體外受精的卵裂率及囊胚發(fā)育率進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，自然裸卵的卵裂率顯著低于COCs的，并且囊胚發(fā)育率的差異達(dá)到了極顯著水平。李榮鳳等試驗結(jié)果也表明，個別自然裸卵是能夠發(fā)育到囊胚的[10]。Yang等研究表明，卵母細(xì)胞成熟過程中的許多機制都需要通過卵丘細(xì)胞來完成，自然裸卵經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后雖然部分能排出第一極體，但沒有繼續(xù)發(fā)育的潛力[11]。本研究并不排除個別特殊卵母細(xì)胞的存在，但其原因仍有待進(jìn)一步探索。

4結(jié)論

體外成熟卵母細(xì)胞在受精液IVF-100中的卵裂率優(yōu)于BO液與TALP液。裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），但差異不顯著；NOs能夠發(fā)育到囊胚階段，但囊胚率極顯著低于COCs的。

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