毛晨晨，葉思思，張?zhí)孛?，韓政，薛向陽，沈賢，3

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，浙江溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

腫瘤/睪丸抗原（cancer/testis antigen，CTA）主要表達在人類生殖系統(tǒng)組織和惡性腫瘤細胞表面，在正常組織中不表達或者很少表達。這其中，精子相關抗原9（sperm associated antigen 9，SPAG-9）是最常見的一種CTA，且可通過調控MAPK信號通路導致腫瘤的發(fā)生[1-2]。研究表明，SPAG-9在腎癌、乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌和大腸癌細胞上均存在過表達的現象[3-7]，且在腎細胞癌、甲狀腺癌和結腸癌等細胞株表面可以檢測到SPAG-9，表明SPAG-9可能為分布于腫瘤細胞表面的膜蛋白[8-9]。另外，在宮頸癌、卵巢癌、結腸癌患者體內均可檢測到針對SPAG-9的抗體[3-5]。由此，SPAG-9可能成為腫瘤免疫治療研究的新靶點[9]。

抗原表位，即抗原分子中決定抗原特異性的特殊結構或數個氨基酸殘基。但是對于SPAG-9尚未有相關研究。本研究利用生物信息軟件系統(tǒng)等預測分析了SPAG-9的B細胞優(yōu)勢表位以及人主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位，首次得到了SPAG-9的表位富集區(qū)，為SPAG-9表位疫苗的設計和研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 SPAG-9優(yōu)勢B細胞表位預測

1.1.1 SPAG-9的氨基酸序列：SPAG-9的氨基酸全長序列檢索自SwissProt蛋白質數據庫。

1.1.2 SPAG-9的二級結構預測：利用EXPASY服務器提供的GOR、SOPMA、Scratch Protein Predictor（SPP）方法（http：//www.expasy.ch/tools）對SPAG-9全長氨基酸序列的二級結構進行預測分析。

1.1.3 SPAG-9跨膜區(qū)域預測：利用CBS服務器上的TMHMM方法（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對SPAG-9全長氨基酸序列的跨膜區(qū)域進行預測分析。

表1 GOR4、SPP、SOPMA 3種方法預測SPAG-9二級結構的構成比[ n（%）]

1.1.4 SPAG-9親水性、極性、表面可及性、抗原性及柔韌性參數預測：綜合EXPASY服務器提供的Hopp&Woods（親水性參數）、Zimmerman（極性參數）（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）與DNAstar軟件的Protein進行的Emini（表面可及性參數）、Jameso-Wolf（抗原性參數）與Karplus-Schulz（柔韌性指數）分析來對SPAG-9的B細胞表位進行預測。

1.1.5 SPAG-9抗原性指數分析：結合上述預測結果，運用吳玉章等[10]建立的抗原性指數確定SPAG-9全長氨基酸的優(yōu)勢B細胞表位富集區(qū)。

1.2 SPAG-9 T細胞表位預測 應用SYFPEITHI服務器上的EPITOPE PREDICTION方法分析預測SPAG9的CTL表位，選取評分較高（score≥20）的多肽。應用NetCTL預測HLA-A2及HLA-A24限制的CTL表位獲得HLA-A2高評分（threshold for epitope identification≥0.75）的多肽和HLA-A24高評分的多肽。應用IEDB預測HLA-A2、HLA-A24限制的CTL表位，選取高評分的多肽（percentile_rank＜5）。綜合SYFPEITHI、Net-CTL及IEDB 3種方法，選取均高評分的HLA-A2限制以及HLA-A24限制的CTL表位肽。

1.3 SPAG-9表位富集區(qū)預測 綜合上述預測得到的優(yōu)勢B細胞表位和HLA限制的CTL表位，得到SPAG-9的表位富集區(qū)。

2 結果

2.1 SPAG-9全長氨基酸序列 SPAG-9共1 321個氨基酸，相對分子質量146 kDa。

2.2 SPAG-9優(yōu)勢B細胞表位預測結果

2.2.1 SPAG-9的二級結構預測：GOR4、SOPMA、SPP 3種方法預測SPAG-9的二級結構，均提示SPAG-9的二級結構以無規(guī)則卷曲為主，亦可見30%～40%的α-螺旋，而少見β-折疊（見表1）。在這3種方案的預測結果中，以至少2種方案相一致的重疊區(qū)域為準，可見無規(guī)則卷曲主要位于N端的1-5，11-17，42-43，182-186，197-232，236-244，2 468-255，268-284，288-300，306-311，323-335，347-372，376-378，391-392，396，443，488-496，539-542，547-551，561-575，578-604，640-642，646-655，658-672，675-684，695-705，715-727，763-768，775-780，788-790，797-819，826-835，840-841，846-887，896-905，910-913，920-934，936-943，951-954，969-970，976-979，986-989，995，998-1 002，1 010-1 011，1 018-1 020，1 028-1 038，1 044-1 049，1 058，1 064-1 066，1 072-1 076，1 081-1 088，1 099-1 100，1 108-1 109，1 117-1 119，1 124-1 129，1 136-1 144，1 154-1 156，1 162-1 165，1 171-1 187，1 194-1 215，1 219-1 225，1 232，1 234-1 235，1 238-1 266，1 274-1 277，1283-1 289，1 293-1 304，1 321區(qū)域。

2.2.2 SPAG-9跨膜區(qū)的預測：使用TMHMM方法對其跨膜區(qū)進行預測分析，結果顯示SPAG-9為膜外蛋白，無跨膜區(qū)。

2.2.3 SPAG-9親水性、極性、表面可及性、抗原性及柔韌性參數預測：SPAG-9的親水性、極性、表面可及性、抗原性參數、柔韌性參數的預測詳見圖1和表2，綜合各種參數的預測結果，SPAG-9 B細胞表位所在的優(yōu)勢區(qū)段為197-200，227-232，237-244，249-255，292-298，306-311，323-327，332-335，348-350，353-358，488-494，539-542，547-550，565-572，588-595，601-604，661-667，677-684，698-702，722-727，801-808，816-819，869-873，875-881，884-887，938-943，1173-1177，1194-1201（抗原性指數≥0，親水性指數≥0，表面可及性指數≥1，極性指數≥12）。

圖1 SPAG-9不同參數的預測結果

2.2.4 SPAG-9抗原性指數分析：綜合SPAG-9的二級結構、親水性、表面可及性、極性、抗原性參數、柔韌性參數的預測一致區(qū)域，計算SPAG-9的B細胞表位區(qū)域的平均抗原性指數，結果顯示N端的197-201，236-243，249-253，291-299，306-312，324-327，332-337，348-352，488-494，539-542，546-550，565-573，699-702，802-807，869-873，875-880，882-887，1 173-1 178，1 195-1 200區(qū)段的抗原性指數相對較高，可能為SPAG-9優(yōu)勢B細胞表位，見表3。

2.3 SPAG-9 T細胞表位預測結果 綜合SYFPEITHI、Net-CTL及IEDB 3種方法均高評分的HLA-A2限制的CTL表位肽為N端的19-27，49-57，50-58，56-64，343-351，381-389，413-421，447-455，521-529，665-673，733-741，837-845，926-934，950-958，964-972，998-1 006，1 016-1 024，1 094-1 102，1 140-1 148，1 150-1 158（見表4）。均高評分的HLA-A24限制的CTL表位肽為31-39，137-145，517-525，943-951（見表5）。

表2 不同參數預測SPAG-9蛋白B細胞表位的肽段區(qū)域

2.4 SPAG-9表位富集區(qū)預測結果 綜合SPAG-9 B細胞表位和CTL表位的預測結果，SPAG-9表位富集區(qū)為N端的332-352，551-573，見圖2。

3 討論

近年來，隨著基因組學、蛋白質組學的飛速發(fā)展，對于腫瘤的治療不僅僅局限于手術治療以及放化療治療，腫瘤特異性治療開始受到廣泛關注。眾所周知，人體免疫系統(tǒng)通過免疫監(jiān)視功能識別和清除突變細胞維持機體的生理平衡穩(wěn)定，而免疫系統(tǒng)所能識別的就是癌變細胞表達的腫瘤抗原，包括腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原。研究表明僅15.4%的腫瘤為病原體持續(xù)感染所引起，所以腫瘤抗原將是腫瘤特異性免疫治療的理想靶點[11]。

抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的一小段序列，能夠被機體免疫效應細胞特異性識別并誘導后續(xù)的免疫反應。而且作為腫瘤特異性治療的靶點，能夠避免天然抗原中對機體產生不利影響的抗原成分，誘導具更強的特異性和更高的免疫效應的特異性免疫應答。以此類特異性抗原表位為基礎所研究的疫苗分子已經展現出了良好的研究前景。SHEN等[12]通過對MAGE-3 B細胞表位的預測和原核表達表位多肽，免疫小鼠之后成功地誘發(fā)了小鼠體液免疫。另外，LIU等[13]將預測的Ewing’s肉瘤的B細胞表位免疫新西蘭白兔，ELISA檢測發(fā)現新西蘭白兔產生了良好的抗體滴度。最近也有研究表明攜帶CTL表位的DNA疫苗能誘發(fā)機體產生很強的針對該表位特異性的CTL反應，通過釋放胞漿內的顆粒（含穿孔素和顆粒酶）等，達到殺傷和清除腫瘤細胞的目的[14-15]。

SPAG-9為一種較新的腫瘤特異膜蛋白，目前尚未見研究以此作為腫瘤特異性免疫治療的靶點。本研究綜合生物信息學方法預測出來的B細胞表位和CTL表位，篩選出的表位富集區(qū)包含多個B細胞表位和CTL表位，其既能夠被B細胞受體以及抗體特異性識別，誘導B細胞活化產生特異性抗體，通過激活補體，介導ADCC作用和發(fā)揮調理作用發(fā)揮抗腫瘤效應[16]，也可以被T細胞受體特異性識別，誘導產生特異性CTL，通過釋放細胞毒顆粒介導細胞毒性反應，引起腫瘤細胞凋亡[17]。而且，不同于以往的單一抗原表位，本研究得到的表位富集區(qū)包含多個抗原表位，大大提高了其作為腫瘤特異性免疫治療靶點的有效性。

對于B細胞表位的預測，本研究綜合二級結構、親水性、抗原性、表面可及性、柔韌性等參數，并將預測結果與與吳玉章等[10]建立的抗原指數相結合，從而對做出科學、合理的預測分析。通常，親水性和表面可及性是形成B細胞表位的首要條件，但決定表位是否具有抗原性尚需綜合考慮多種因素，蛋白質序列中肽鏈的柔韌性與相應部位的抗原性也密切相關。另外，蛋白質的二級結構對抗原表位也有很大影響。α-螺旋、β-折疊的化學鍵鍵能比較高，在牢固維持蛋白質高級結構上發(fā)揮重要的作用，但是卻很難合適地與抗體嵌合，且經常處于蛋白質的內部，因而很少位于抗原表位所在區(qū)域。相反，β-轉角及無規(guī)則卷曲則比較松散，且易于發(fā)生扭曲盤旋，并展示在蛋白質的表面，成為抗原表位的可能性較大。另外，親水性較高的區(qū)域可使抗原抗體更好地結合，柔韌性較強的氨基酸殘基更易形成抗原表位。所以綜合上述方法，本研究結果發(fā)現SPAG-9氨基酸序列N端的197-201，236-243，249-253，291-299，306-312，324-327，332-337，348-352，488-494，539-542，546-550，565-573，699-702，802-807，869-873，875-880，882-887，1 173-1 178，1 195-1 200綜合評分較高。

表3 SPAG-9的B細胞表位的平均抗原性指數

表4 SPAG-9 HLA-A2限制CTL表位3種方法評分均高的預測結果

表5 SPAG-9 HLA-A24限制CTL表位3種方法評分均高的預測結果

圖2 SPAG-9表位富集區(qū)預測結果

而對于T細胞表位的預測，基于已經有研究發(fā)現HLA-A2是我國人群的優(yōu)勢基因（HLA-A24在我國人群也有較高的頻率分布[18]，本研究綜合SY-FPEITHI、Net-CTL及IEDB 3預測方法，篩選HLA-A2限制性的CTL表位19-27，49-57，50-58，56-64，343-351，381-389，413-421，447-455，521-529，551-559，665-673，733-741，837-845，926-934，950-958，964-972，998-1 006，1 016-1 024，1 094-1 102，1 140-1 148，1 150-1 158，A24限制性的CTL表位為31-39，137-145，517-525，943-951。

綜合上述預測結果，優(yōu)先考慮HLA-A2限制的T細胞表位，我們發(fā)現SPAG-9氨基酸序列N端332-352，551-573富含B、T細胞表位，即SPAG-9氨基酸序列N端332-352，551-573為其表位富集區(qū)，這能夠為下一步SPAG-9的表位疫苗的研究提供理論基礎。