黃愛芳，王陳翔，周曉潔，金輝，周彬，余旭奔，林觀樣

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325015）

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是體內(nèi)多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的主要代謝酶，其活力改變能使相關(guān)物質(zhì)代謝環(huán)節(jié)受到干擾，引起生物學(xué)效應(yīng)的變化[1]。CYP450酶的誘導(dǎo)或抑制作用是導(dǎo)致藥物間相互作用的主要原因之一，當(dāng)兩種或兩種以上藥物合用或前后序貫用藥時(shí)，其中一種能通過調(diào)節(jié)CYP450酶的活力影響另一種藥物的體內(nèi)代謝過程。除化學(xué)藥物外，也有文獻(xiàn)[2]報(bào)道中藥能通過對CYP450酶的調(diào)節(jié)間接影響在用藥物的血藥濃度和半衰期，導(dǎo)致被影響藥物療效和不良反應(yīng)的變化。

土忍翹薇成方于已故老中醫(yī)陳蘇生，由土茯苓、忍冬藤、連翹和白薇組成，在陳蘇生醫(yī)案[3]和《陳蘇生醫(yī)集纂要》[4]中均有記載。該組方具有搜風(fēng)通絡(luò)、解毒利濕的作用，可用于拮抗激素不良反應(yīng)。中藥的化學(xué)成分是其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，土茯苓、忍冬藤、連翹和白薇這四味中藥均含有黃酮類和天然甾體成分[5-8]，它們可以改變代謝酶的活性中心構(gòu)象或者競爭代謝酶的結(jié)合位點(diǎn)，使其酶活力發(fā)生改變。因此本研究設(shè)計(jì)以非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗、咪達(dá)唑侖為探針底物，考察土忍翹薇方對體內(nèi)CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1代謝活力的影響，同時(shí)檢測4種亞型酶的基因表達(dá)水平，綜合分析土忍翹薇方使用后代謝酶的變化，以預(yù)測合用藥物時(shí)的代謝規(guī)律。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性8周SD大鼠20只，體質(zhì)量220～250 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2015-0001，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，室溫控制在（25±3）℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 主要儀器 XEVO TQ-S micro質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源（美國Waters科技有限公司）；ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters科技有限公司）；DU640核酸和蛋白分析儀（美國Beckman儀器有限公司）；MyCycler熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad有限公司）；7500 RT-PCR儀（美國Applied Biosystems科技有限公司）。

1.3 試劑 咪達(dá)唑侖（批號：171250-200401）、安非他酮（批號：100671-201001）和地西泮（批號：171225-200903）購自中國食品藥品檢定研究院；非那西?。ㄅ枺篠TBB2177M9）、氯唑沙宗（批號：B（乙腈），梯度洗脫：0～1.5 min（10%～70% B），1.5～2.2 min（70%～70% B），2.2～2.5 min（70%～10% B），2.5～4.0 min（10%～10% B）。ESI（電噴霧離子源），源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔氣流量50（L/Hr），脫溶劑氣流量1 000（L/Hr），氬氣流量0.15 mL/min。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行定量，各探針?biāo)幒蛢?nèi)標(biāo)的檢測參數(shù)如表1所示。

表1 探針?biāo)幖皟?nèi)標(biāo)的檢測參數(shù)

2.1.4 探針?biāo)帩舛扔?jì)算：非那西丁和氯唑沙宗在5～5 000 ng/mL血藥濃度范圍，安非他酮和咪達(dá)唑侖在5～1 000 ng/mL血藥濃度范圍制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行方法學(xué)考察。血樣經(jīng)2.1.2項(xiàng)下處理后根據(jù)2.1.3項(xiàng)下的檢測方法進(jìn)樣得到峰面積，運(yùn)用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到探針?biāo)幍臐舛取?/p>

2.2 RT-PCR法測定土忍翹薇合劑對大鼠CYP450酶mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 動物給藥與取樣：8只SD大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃6 mL/kg土忍翹薇合劑，對照組灌胃等劑量純凈水，給藥持續(xù)14 d。最后一次給藥后24 h處死，迅速取肝臟組織于-80 ℃冰箱保存。

2.2.2 RNA提取：按試劑盒說明書提取肝臟總RNA，于260 nm和280 nm測定吸光度，兩者比值介于1.8和2.0之間視為提取的RNA純度合格，同時(shí)根據(jù)260 nm吸光值將RNA濃度調(diào)整至1 μg/μL，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.2.3 cDNA合成：取1 μg總RNA，分別加入1 μL random hexamer primer、4 μL 5×Reaction buffer、1 μL RiboLock RNase Inhibitor、2 μL dNTP mix、1 μL RebertAid M-MuLV Transcriptase和10 μL nuclease-free water至終體積20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，最后70 ℃5 min終止反應(yīng)，得到的cDNA產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 RT-PCR測定mRNA表達(dá)水平：取2 μL cDNA產(chǎn)物，分別加入10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、20 mmol/L上下游引物各0.5 μL、7 μL nuclease-free water，使反應(yīng)終體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。測定樣本CT值后，采用2-ΔΔCT法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組CYP450酶基因表達(dá)相對于對照組的倍數(shù)變化。大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1和β-actin（內(nèi)參）引物序列見表2。

表2 大鼠CYP450酶引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示，藥動學(xué)參數(shù)使用DAS2.0軟件計(jì)算，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 土忍翹薇合劑對大鼠CYP450酶活力的影響 4種探針?biāo)幒蛢?nèi)標(biāo)色譜圖如圖1所示，非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗、咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)地西泮及甲苯磺丁脲的保留時(shí)間分別為1.76、1.67、1.89、1.77、2.23和2.09 min。血漿中4種探針?biāo)幾畹蜋z測限均為5 ng/mL，在線性范圍內(nèi)4種探針?biāo)幦諆?nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于8%，相對回收率均在95%～101%，絕對回收率均大于80%。本方法具有較高專屬性，適用于同時(shí)測定大鼠血漿中4種探針?biāo)幍臐舛取?/p>

采集的血樣運(yùn)用建立的方法進(jìn)行血藥濃度測定，繪制平均藥時(shí)曲線圖和計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，如圖2與表3所示。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)灌胃土忍翹薇合劑14 d后，非那西丁的清除率（Clz/F）提高了42%，曲線下面積（AUC0-t）減少了31%，達(dá)峰濃度（Cmax）減少了33%（P＜0.05），說明土忍翹薇合劑對CYP1A2活力具有顯著誘導(dǎo)作用；實(shí)驗(yàn)組咪達(dá)唑侖的Clz/F提高了66%，AUC0-t和Cmax分別為對照組的57%和52%，表觀分布容積（Vz/F）增加了1.36倍（P＜0.05），說明土忍翹薇合劑對CYP3A1活力具有顯著誘導(dǎo)作用；安非他酮和氯唑沙宗藥時(shí)曲線圖和藥動學(xué)參數(shù)均提示土忍翹薇合劑對CYP2B1和CYP2E1活力無明顯影響。

3.2 土忍翹薇合劑對大鼠CYP450酶mRNA表達(dá)的影響 如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP1A2和CYP3A1 mRNA表達(dá)分別上調(diào)為對照組的2.26倍和1.94倍（P＜0.05），而CYP2B1與CYP2E1 mRNA表達(dá)2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

不同物種之間CYP450基因序列具有一定相似性，經(jīng)比對，大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1與人CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4 mRNA序列分別具有70%、74%、81%、73%同源性[10]，因此這4個(gè)大鼠CYP450亞型酶變化可以作為人CYP450酶變化的參考。

觀察對應(yīng)底物的藥動學(xué)參數(shù)可以評估CYP450酶的活力[11-13]，本研究運(yùn)用前期建立的cocktail探針法，通過酶底物非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗和咪達(dá)唑侖的藥動學(xué)改變來評估大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1的酶活力變化，同時(shí)用RTPCR法測定CYP450的mRNA表達(dá)水平，從酶活力和基因表達(dá)2方面檢測土忍翹薇合劑對CYP450的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土忍翹薇合劑對CYP1A2和CYP3A1均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。

圖1 大鼠血漿中探針?biāo)幒蛢?nèi)標(biāo)的液質(zhì)檢測色譜圖

圖2 對照組與實(shí)驗(yàn)組探針?biāo)幍钠骄帟r(shí)曲線圖（n=6）

表3 探針?biāo)幩巹訉W(xué)參數(shù)（n=6， ±s）

圖3 對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP450酶mRNA表達(dá)水平比較

人體內(nèi)CYP1A2主要在肝臟分布，約占CYP450總量的13%左右，負(fù)責(zé)約二十多種藥物的體內(nèi)代謝，包括華法林、茶堿、氯氮平和氟哌啶醇等窄治療窗藥物[14]。CYP3A4在人體內(nèi)的含量和代謝藥物種類均位于CYP亞酶的首位，參與約50%以上臨床常用藥物的生物轉(zhuǎn)化，涉及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、抗真菌藥、HMG-CoA還原酶抑制劑、苯二氮卓類、質(zhì)子泵抑制劑、鈣通道阻滯劑等[15]。在使用以上藥物治療期間，如服用土忍翹薇方可能會加速其在體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致治療效果的波動，需要密切關(guān)注。此外，土忍翹薇合劑在酶活力和基因表達(dá)水平對大鼠CYP450酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)趨勢同步，說明土忍翹薇合劑對酶活力的影響可能是通過調(diào)控mRNA表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)。

近十多年，本院一直用土忍翹薇方防治糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)，患者獲益明顯。土忍翹薇方取土茯苓除濕通絡(luò)利關(guān)節(jié)、忍冬藤清熱解毒通經(jīng)、連翹清熱解毒散結(jié)及白薇清虛實(shí)兩熱等作用，以中醫(yī)藥的理論分析，本方組合符合糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)的防治思路，但如何使用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論對土忍翹薇方的藥理作用進(jìn)行解釋，是目前面臨的難題。本研究發(fā)現(xiàn)，土忍翹薇合劑能同時(shí)增強(qiáng)CYP3A1酶活力和mRNA表達(dá)，在人體內(nèi)CYP3A4同時(shí)也是外源性激素（糖皮質(zhì)激素）的代謝酶，CYP3A4上調(diào)可以下調(diào)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的濃度，使其對垂體分泌腎上腺皮質(zhì)激素的抑制作用減弱，進(jìn)而達(dá)到拮抗糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)的目的。

中藥方劑成分復(fù)雜，單味中藥就含有大量的活性成分，而每種成分也具有不同的藥理作用，如果將中藥方劑簡單地作為多種單體成分的加減反應(yīng)是不科學(xué)的。本研究將土忍翹薇方作為一個(gè)整體，用探針?biāo)幬锓ê蚉CR法來評估其對代謝酶的影響，對于該方在臨床上的合理應(yīng)用，提高聯(lián)合用藥的安全性和有效性，促進(jìn)中藥基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代化研究均具有重要的意義。