基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣不同發(fā)酵期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)演替

關(guān)統(tǒng)偉，向慧平，王鵬昊，鄧奧宇，董 丹，趙順先，張習(xí)超

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

郫縣年均氣溫15.7 ℃，相對(duì)濕度70%，氣候溫和，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，無(wú)霜期長(zhǎng)。這些環(huán)境因素為郫縣豆瓣微生物菌群的生存提供了最佳環(huán)境，協(xié)同優(yōu)質(zhì)的蠶豆和二荊條辣椒，憑借300多年的開放式傳統(tǒng)釀造技藝，共同造就了郫縣豆瓣獨(dú)特的風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)和不可復(fù)制的產(chǎn)品特點(diǎn)，也是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)報(bào)道了一些關(guān)于郫縣豆瓣細(xì)菌類群的研究，大多為純培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)了一些有價(jià)值的細(xì)菌類群，如乳酸菌、芽孢桿菌等[1-4]。由于純培養(yǎng)的局限性，一些非培養(yǎng)技術(shù)被運(yùn)用到郫縣豆瓣細(xì)菌類群的研究中。張琦等[5]運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)研究了郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化；趙紅宇等[6]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)郫縣豆瓣對(duì)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。鑒于開放式的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中環(huán)境的復(fù)雜性、污染的不可控性以及產(chǎn)品風(fēng)味的不穩(wěn)定性因素，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)全面地研究郫縣豆瓣整個(gè)發(fā)酵期不同階段的細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)演替規(guī)律，以確定不同發(fā)酵期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群體及其可能的污染細(xì)菌，為開發(fā)郫縣豆瓣專用細(xì)菌菌劑，保障產(chǎn)品風(fēng)味質(zhì)量的穩(wěn)定性以及安全性提供理論參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)共采集了郫縣豆瓣6 個(gè)發(fā)酵時(shí)期的樣本，豆瓣樣本編號(hào)分別為：BZ1Y、BZ5Y、BZ10Y、peijiao、HE1Y和HE5Y。樣品采集使用多點(diǎn)取樣法，通過(guò)在發(fā)酵池的兩端以及中間3 個(gè)位置分別取上、中、下層等量豆瓣樣品，混合均勻備用。6 個(gè)時(shí)期的樣本信息分別為編號(hào)BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y 3 個(gè)樣本分別在甜瓣子發(fā)酵的第1個(gè)月、第5個(gè)月和第10個(gè)月采樣；編號(hào)peijiao取樣至發(fā)酵3 個(gè)月的成熟新鮮辣椒醅；編號(hào)HE1Y和HE5Y是將發(fā)酵10 個(gè)月的甜瓣子（BZ10Y）和發(fā)酵3 個(gè)月的辣椒醅（peijiao）混勻后的發(fā)酵階段，混合發(fā)酵時(shí)間分別為1 個(gè)月和5 個(gè)月。

TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TMDNA Marker 大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K 德國(guó)Merck公司；溶菌酶 美國(guó)Sigma公司；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 美國(guó)Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5430高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；My Cycler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Bio-Best 200E型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)西蒙公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MX-S型可調(diào)式混勻儀美國(guó)賽洛捷克公司；核酸蛋白微量檢測(cè)儀 美國(guó)MD SpectraMax Drop公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取及其高通量測(cè)序

采用倪崢飛等[7]的液氮研磨＋溶菌酶＋十二烷基硫酸鈉高鹽抽提法提取郫縣豆瓣中的細(xì)菌總宏基因組，然用核酸蛋白儀檢測(cè)DNA的濃度和純度。高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。V3-V4可變區(qū)采用的測(cè)序引物是“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”和“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”；同時(shí)V4-V可變5區(qū)采用的測(cè)序引物是“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”和“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”。最終得到的序列用于OTU分析，使用VSEARCH進(jìn)行序列聚類（序列相似性設(shè)為97%），用RDP classifier（核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，Ribosomal Database Program，RDP）貝葉斯算法[8]對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析。基于OTU的分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，分別計(jì)算Shannon、Chao1等Alpha多樣性指數(shù)，并作出稀釋曲線。通過(guò)Unweighted UniFrac分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異，基于Unweighted UniFrac樣本間距離矩陣用于主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可視化2D圖展示Beta多樣性等。

1.3.2 樣品序列的提交及序列注冊(cè)號(hào)獲取

通過(guò)ENA的FTP服務(wù)器，將郫縣豆瓣不同發(fā)酵時(shí)期的樣品高通量測(cè)序所得fastq序列文件提交到了ENASRA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.ac.uk/ena/submit），獲得其接受號(hào)為PRJEB17866。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與OTU分析

按照條形碼標(biāo)簽完全匹配方式提取測(cè)序序列，高通量測(cè)序中通常會(huì)出現(xiàn)一些點(diǎn)突變等測(cè)序錯(cuò)誤，而且序列末端的質(zhì)量比較低，為了得到更高質(zhì)量及更準(zhǔn)確的生物信息分析結(jié)果，需要對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理。優(yōu)化處理軟件選用Trimmomatic（v0.30 http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic）。將上面過(guò)濾后的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)，如表1所示。通過(guò)郫縣豆瓣不同發(fā)酵時(shí)期各樣品中細(xì)菌的16S rRNA基因測(cè)序，6 個(gè)樣品總計(jì)測(cè)得原始序列條數(shù)為1 543 610 條，過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列后，總數(shù)為1 507 972 條。在上述序列進(jìn)行去冗余處理后，有效序列數(shù)731 188 條，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，共產(chǎn)生37 082 個(gè)，統(tǒng)計(jì)得到所有樣品在不同OTU中的豐度信息，各樣品測(cè)序信息結(jié)果如表1所示。peijiao樣品中的OTU最多，達(dá)到了23 362 個(gè)，HE5Y樣品中的OTU最少，僅為1 847 個(gè)。

表1 不同發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table1 Statistics of bacterial genomic sequence data for Pixian bean paste samples from different fermentation stages

稀釋曲線反映了測(cè)序的深度，也可以用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋樣品所有種群。從圖1可知，5個(gè)樣品（BZ1Y、BZ5Y、BZ10Y、HE1Y和HE5Y）稀釋曲線均基本趨于平緩，說(shuō)明所得序列可基本反映真實(shí)環(huán)境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；但樣品peijiao呈現(xiàn)一種上升的趨勢(shì)，很大程度上未達(dá)到飽和，說(shuō)明表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生新的OTU。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣細(xì)菌稀有度曲線Fig. 1 Rarefaction curves for bacterial communities in Pixian bean paste samples from different fermentation stages

2.2 樣品間Alpha多樣性分析

表2 樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Table2 Alpha diversity of bacterial communities at different fermentation stages

采用Alpha多樣性指標(biāo)中的ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)對(duì)樣品序列文庫(kù)的OUT數(shù)目、群落的異質(zhì)性以及估計(jì)群落中物種總數(shù)。由表2可以看出，郫縣豆瓣不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌Shannon指數(shù)從最初的4.77到發(fā)酵結(jié)束的4.48，其變化不大，表明樣品中群落種群差異性相對(duì)較小，但在peijiao發(fā)酵期，該指數(shù)顯著增高，說(shuō)明該時(shí)期的細(xì)菌種群差異大。而OTU數(shù)、Chao1和ACE指數(shù)均明顯低于發(fā)酵初期（BZ1Y）樣品，則表明隨著發(fā)酵的深入和環(huán)境的不斷變化，樣品中細(xì)菌群落的種群多樣性和總體豐度不斷降低。

2.3 樣品間Beta多樣性分析

Beta多樣性指沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率也被稱為生境間的多樣性。不同群落或某環(huán)境梯度上不同點(diǎn)之間的共有種越少，Beta多樣性就越大。群落生態(tài)學(xué)中，Beta多樣性主要描述物種組成在時(shí)空尺度上的變化。Beta多樣性分析可通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法PCoA實(shí)現(xiàn)，直觀顯示不同環(huán)境樣品中微生物進(jìn)化上的相似性及差異性。

圖2 樣本間細(xì)菌群落PCAFig. 2 PCA results of microbial communities from Pixian bean paste

主成分分析（principal component analysis，PCA）表明（圖2），PC1和PC2分別在樣品差異性貢獻(xiàn)率上達(dá)到72.17%和17.71%，合計(jì)達(dá)到89.88%，是差異的主要來(lái)源。PCA樣品BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y距離最近，均位于PC2的正值區(qū)域，說(shuō)明三者細(xì)菌群落的相似度較高；其次HE1Y與HE5Y相近性次之，樣品HE1Y與HE5Y分別處于均位于PC2的負(fù)值區(qū)域，分別位于PC1坐標(biāo)軸正側(cè)，較為靠近的位置，說(shuō)明兩樣品間的主成分變異不顯著；PCA可以看出，5 個(gè)樣品與peijiao樣品的距離較遠(yuǎn)，細(xì)菌群落組相似度較低。總體而言，不同發(fā)酵環(huán)境及其周期的不同，也顯示出樣品中細(xì)菌群落的分布顯著變化。

2.4 樣品間門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用RDP classifier對(duì)各樣品中的OTU依次進(jìn)行門、綱、目、科、屬的分類信息分析，一共獲得11 個(gè)門的細(xì)菌和一些無(wú)法歸類的細(xì)菌（圖3）。這些門分別為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Chlorobi、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Fusobacteria、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria和Deferribacteres。在甜瓣子發(fā)酵時(shí)期（BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y）與辣椒瓣子混合發(fā)酵階段（HE1Y與HE5Y）Firmicutes是優(yōu)勢(shì)種群，占到各時(shí)期細(xì)菌種群的50.7%～90.9%；而在辣椒醅發(fā)酵階段（peijiao）Firmicutes僅占該時(shí)期細(xì)菌種群的4.2%，而Proteobacteria和Cyanobacteria中的細(xì)菌成為peijiao時(shí)期發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)群體，分別占全部細(xì)菌總數(shù)的70.4%和24%。另外，BZ1Y序列分析表明數(shù)量較多的細(xì)菌群體分別是Firmicutes（80.5%）、Proteobacteria（8.1%）和Actinobacteria（10%）；BZ5Y的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群是Firmicutes（86.5%）、Proteobacteria（3%）和Actinobacteria（9.7%）；發(fā)酵10 個(gè)月后，優(yōu)勢(shì)群體的種類沒(méi)有改變，但數(shù)量已經(jīng)發(fā)生了變化，BZ10Y中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria的含量分別變化為90.9%、5.4%和2.7%。由于辣椒醅混入豆瓣發(fā)酵，帶入了新的細(xì)菌類群，因此在混合1個(gè)月發(fā)酵（HE1Y）后優(yōu)勢(shì)細(xì)菌成為Firmicutes（52.7%）、Cyanobacteria（10.6%）、Proteobacteria（30.7%）和Actinobacteria（5.7%）；混合發(fā)酵豆瓣成熟后（HE5Y）優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Firmicutes（70.7%）、Cyanobacteria（17.1%）、Proteobacteria（6.4%）和Actinobacteria（5.5%）。說(shuō)明郫縣豆瓣整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌種群始終處于動(dòng)態(tài)的變化當(dāng)中。

圖3 門水平各樣本菌群分布圖Fig. 3 Phylum frequencies of microbial communities from samples

2.5 樣品間屬水平的細(xì)菌群落分布

通過(guò)高通量測(cè)序，郫縣豆瓣整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共有185 個(gè)屬的細(xì)菌和部分未能分類的細(xì)菌被挖掘。屬水平的細(xì)菌群落數(shù)量在前50的屬熱圖分析（圖4）表明，測(cè)序結(jié)果中組成比例較高的前50 個(gè)屬分別是Hafnia、Methylobacterium、Paracoccus、Chromohalobacter、Halanaerobium、Halomonas、Ochrobactrum、Rhizobium、Rahnella、Wohlfahrtiimonas、Pectobacterium、Tatumella、Empedobacter、Klebsiella、Myroides、Acinetobacter、Stenotrophomonas、Serratia、Lampropedia、Alcaligenes、Brachybacterium、Leucobacter、Providencia、Brevibacterium、Ignatzschineria、Enterococcus、Arthrobacter、Lactococcus、Jeotgalicoccus、Kurthia、Proteus、Morganella、Paenochrobactrum、Lentibacillus、Oceanobacillus、Gracilibacillus、Virgibacillus、Staphylococcus、Pantoea、Enterobacter、Pseudomonas、Brenneria、Leuconostoc、Vagococcus、Weissella、Tetragenococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Corynebacterium和Bacillus。熱圖分析表明了郫縣豆瓣不同發(fā)酵時(shí)期樣品間不同細(xì)菌屬的相對(duì)豐度以及細(xì)菌組成的差異性和和樣品間的相似性。如熱圖中的BZ1Y樣品中檢測(cè)到38 個(gè)屬，BZ5Y中37 個(gè)屬，BZ10Y中36 個(gè)屬；單獨(dú)發(fā)酵成熟的peijiao樣品中檢測(cè)到44 個(gè)屬，由于辣椒醅的混入，瓣子與辣椒醅的混合發(fā)酵HE1Y樣品中有47 個(gè)屬，隨著混合發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，在成品豆瓣HE5Y樣品中獲得42 個(gè)屬。樣品間屬水平的聚類關(guān)系（圖4）可以看出BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y聚在一起，表明3個(gè)樣品的相似度較高；HE1Y與HE5Y的相似度也較高，而peijiao樣品形成了一個(gè)獨(dú)立的分支，說(shuō)明peijiao與其他5 個(gè)樣品的相似度較低，與其他5 個(gè)樣品的細(xì)菌組成差異較大。這個(gè)結(jié)果也符合郫縣豆瓣的實(shí)際發(fā)酵情況，因?yàn)閜eijiao樣品是單獨(dú)發(fā)酵的，與甜瓣子的發(fā)酵環(huán)境、材料等差異較大。

圖4 不同樣品間的細(xì)菌熱圖Fig. 4 Heat map of bacteria in different samples

圖5 各樣品在屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異Fig. 5 Bacterial community structures of all the samples at the genus level

圖5 反映了不同樣品間屬水平細(xì)菌（前50）群落組成的變化情況。在瓣子發(fā)酵初期（BZ1Y）的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Staphylococcus（65.31%）、Corynebacterium（3.45%）、Brevibacterium（3.75%）、Ignatzschineria（2.46%）、Lactobacillus（2.26%）和Pediococcus（2.24%）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行Staphylococcus的含量逐漸上升，Corynebacterium數(shù)量先上升后下降，Brevibacterium的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在瓣子發(fā)酵的中期（BZ5Y）的主要細(xì)菌為Staphylococcus（74.07%）、Corynebacterium（6.99%）、Bacillus（4.24%）和Weissella（2.49%），Bacillus和Weissella的細(xì)菌出現(xiàn)大幅增長(zhǎng)。同時(shí)，也存在著多種新物種的出現(xiàn)和初始物種的消失，如Jeotgalicoccus是瓣子發(fā)酵初期的原始物種，而到了發(fā)酵后期未被檢測(cè)到。Brenneria和Methylobacterium出現(xiàn)在瓣子發(fā)酵的中期，但在發(fā)酵初期和發(fā)酵后期均未檢測(cè)到；而Halomonas和Paracoccus也出現(xiàn)在瓣子發(fā)酵中期，隨后一直存伴隨于瓣子的發(fā)酵過(guò)程。到了瓣子發(fā)酵的末期（BZ10Y），優(yōu)勢(shì)菌群為Staphylococcus（79.93%）、Pediococcus（3.28%）、Lactobacillus（3.22%）、Corynebacterium（2%）和Weissella（2%）。此時(shí)，同步單獨(dú)發(fā)酵的辣椒醅（peijiao）成品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Pantoea（13.08%）、Pseudomonas（2.32%）、Enterobacter（2.26%）和Brenneria（2.16%），并且有高達(dá)44.72%的物種未歸類，這些物種可能存在一些新的物種信息，值得深入研究。在辣椒醅與瓣子混合的初期HE1Y中優(yōu)勢(shì)菌為Staphylococcus（25.26%）、Weissella（11.51%）、Tetragenococcus（5.57%）、Pantoea（5.35）和Corynebacterium（3.78%）；到了發(fā)酵末期，成熟豆瓣HE5Y中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌變?yōu)镾taphylococcus（43.81%）、Tetragenococcus（6.81%）、Weissella（4.89%）、Corynebacterium（3.41%）和Lactobacillus（3.09%）。因此，郫縣豆瓣的發(fā)酵過(guò)程中伴隨著優(yōu)勢(shì)種群的數(shù)量和種類的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)也影響著產(chǎn)品的質(zhì)量與風(fēng)味。

3 討 論

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的純培養(yǎng)微生物還不到自然界微生物總量的1%[9]，因此，利用傳統(tǒng)分離技術(shù)全面揭示樣品中的微生物組成幾乎不可能。宏基因組學(xué)于1998年提出[10]，隨后高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)不僅使得環(huán)境微生物被全貌解析成為可能[11]；近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)也廣泛的應(yīng)用于水環(huán)境、陸地、腸道、動(dòng)植物等環(huán)境微生物檢測(cè)[12-18]，而且在在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生產(chǎn)管理、微生物疾病控制和生態(tài)評(píng)估等方面發(fā)揮著重要意義[19-21]。

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)食品微生物發(fā)酵過(guò)程和機(jī)制研究產(chǎn)生了深刻的影響，對(duì)食品發(fā)酵工程優(yōu)化提供了很好的數(shù)據(jù)支撐[22-26]。郫縣豆瓣作為我國(guó)著名的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，開放式的半固態(tài)發(fā)酵體系和適宜的郫縣氣候條件高效的網(wǎng)羅了大量環(huán)境細(xì)菌參與豆瓣釀造。這些環(huán)境中的細(xì)菌，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移而發(fā)生著顯著的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，悠久的釀造歷史也使得一些細(xì)菌在高鹽濃度條件下逐漸適應(yīng)，并成為郫縣豆瓣中的優(yōu)勢(shì)種群，為郫縣豆瓣風(fēng)味和質(zhì)量的穩(wěn)定性保駕護(hù)航。本研究完成了郫縣豆瓣全發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌高通量測(cè)序，結(jié)果表明伴隨于整個(gè)郫縣豆瓣發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為：Staphylococcus、Weissella、Pediococcus、Lactobacillus、Corynebacterium和Bacillus，它們?cè)跀?shù)量上隨發(fā)酵時(shí)間有所變化，但相對(duì)比較穩(wěn)定；毫無(wú)疑問(wèn)，它們對(duì)郫縣豆瓣的質(zhì)量與風(fēng)味產(chǎn)生重要的影響。這些研究成果也為未來(lái)開發(fā)郫縣豆瓣專用細(xì)菌菌劑提供了很好的參考價(jià)值。張琦等[5]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳對(duì)郫縣豆瓣細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)Staphylococcus xylosus是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，本研究中Staphylococcus中的細(xì)菌數(shù)量（25%～80%）也在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。通常Staphylococcus中的金黃色葡萄球菌為致病菌，表皮葡萄球菌中有部分是致病菌，S. xylosus是弱致病性的，而腐生葡萄球菌是不致病的。葡萄球菌屬的細(xì)菌部分具有耐鹽性，生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求不高，可能將導(dǎo)致豆瓣醬成品質(zhì)量檢測(cè)不合格。Staphylococcus在郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程中具體起著有益的還是有害的作用都需進(jìn)一步深入探索。因此，在生產(chǎn)中需要多加關(guān)注Staphylococcus菌群的生產(chǎn)控制，在未來(lái)研發(fā)中要闡明此類菌群的功能性。Bacillus也是郫縣豆瓣的優(yōu)勢(shì)種群，這與筆者前期的純培養(yǎng)結(jié)果[1,3,27]以及趙紅宇等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。另外，首次發(fā)現(xiàn)Pediococcus和Corynebacterium作為郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌。據(jù)研究[28-30]Pediococcus在釀酒環(huán)境中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)該菌在豆瓣中的功能還需要進(jìn)一步探索，以便于更好地為郫縣豆瓣產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；同F(xiàn)代化服務(wù)。

[1] 董丹, 關(guān)統(tǒng)偉, 趙輝平, 等. 兩個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣中微生物多樣性的差異對(duì)比[J]. 中國(guó)釀造, 2014, 33(11): 55-58. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.012.

[2] ZOU Y L, XIANG W L, RAO Y, et al. Diversity analysis of bacteria in the latter ripening of Pixian soybean paste fermentation based on 16S rDNA analysis[J]. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(42):7008-7012. DOI:10.5897/AJMR12.1341.

[3] 趙輝平, 關(guān)統(tǒng)偉, 董丹, 等. 郫縣豆瓣中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析及酶活性初篩[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2015, 40(8): 5-9. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2015.08.002.

[4] 劉超蘭, 黃著, 彭熙敏, 等. 乳酸菌和酵母共培養(yǎng)技術(shù)縮短郫縣豆瓣醬陳釀期的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009, 28(3): 105-108.DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2009.03.032.

[5] 張琦, 汪先丁, 楊虎, 等. 郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 16-18. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2010.06.005.

[6] 趙紅宇, 徐煒楨, 楊國(guó)華, 等. 基于高通量測(cè)序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細(xì)菌多樣性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 117-122. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710020.

[7] 倪崢飛, 許偉, 竇文芳, 等. 鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵醋醅中微生物總DNA提取方法比較[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2010(1): 119-125. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2010.01.011.

[8] WANG Q, GARRITY M G, TIEDIE M J, et al. Bayesianclassifier for rapid assignment of rRNA sequencesinto the new bacterial taxonomy[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.DOI:10.1128/AEM.00062-07.

[9] AMANN R I, LUDWIG W, SCHLEIFER K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(1): 143-169.

[10] HANDESMAN J, RONDON M R, BRADY S F, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology, 1998, 5(10):245-249. DOI:10.1016/S1074-5521(98)90108-9.

[11] GLENN T C. Field guide to next-generation DNA sequencers[J].Molecular Ecology Resources, 2011, 11(5): 759-769. DOI:10.1111/j.1755-0998.2011.03024.x.

[12] 葉雷, 閆亞麗, 陳慶森, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 16(7): 216-223.DOI:10.16429/j.1009-7848.2016.07.029.

[13] TURNBAUGH P J, RIDAURA V K, FAITH J J, et al. The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomicanalysis in humanized gnotobioticmice[J]. Science Translational Medicine, 2009,1(6): 6799-6806. DOI:10.1126/scitranslmed.3000322.

[14] ZHANG C H, ZHANG M H, WANG S Y, et al. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice[J]. The ISME Journal, 2009, 4(2): 232-241. DOI:10.1038/ismej.2009.112.

[15] 葛英亮, 于水利, 時(shí)文歆, 等. 應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析O3-BAC飲用水處理過(guò)程細(xì)菌多樣性變化[J]. 食品科學(xué), 2016,37(16): 223-228. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201616036.

[16] ARFI Y, BUéE M, MARCHAND C, et al. Multiple markers pyrosequencing reveals highly diverse and host- specific fungal communities on the mangrove trees Avicennia marina and Rhizophora stylosa[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 79(2): 433-444.DOI:10.1111/j.1574-6941.2011.01236.x.

[17] 王佩雯, 朱金峰, 陳征, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)下連作植煙土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的耦合分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 24(11):1754-1763. DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2016.11.013.

[18] 李旭光, 齊占會(huì), 林琳, 等. 基于高通量測(cè)序分析的大鵬澳海域沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)初步研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2015(6): 1-8.DOI:10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.001.

[19] TABERLET P, COISSAC E, POMPANON F, et al. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding[J]. Molecular Ecology, 2012,21(8): 2045-2050. DOI:10.1111/j.1365-294X.2012.05470.x.

[20] YU D W, JI Y Q, EMERSON B C, et al. Biodiversity soup:metabarcoding of arthropods for rapid biodiversity assessment and biomonitoring[J]. Methods in Ecology and Evolution, 2012, 3(4): 613-623. DOI:10.1111/j.2041-210X.2012.00198.x.

[21] JI Y Q, ASHTON L, PEDLEY S M, et al. Reliable, verifiable and efficient monitoring of biodiversity viametabarcoding[J]. Ecology Letters,2013, 16(10): 1245-1257. DOI:10.1111/ele.12162.

[22] 吳林寰, 陸震鳴, 龔勁松, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1164-1174. DOI:10.13345/j.cjb.150552.

[23] WOLFE B E, BUTTON J E, SANTARELLI M, et al. Cheese rind communities provide tractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity[J]. Cell, 2014, 158(2): 422-433. DOI:10.1016/j.cell.2014.05.041.

[24] LIU W, XI X, SUDU Q, et al. High-throughput sequencing reveals microbial community diversity of Tibetan naturally fermented yak milk[J]. Annals of Microbiology, 2015, 65(3): 1741-1751.DOI:10.1007/s13213-014-1013-x.

[25] 鄧杰, 黃治國(guó), 衛(wèi)春會(huì), 等. 基于高通量測(cè)序的濃香型白酒窖池細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(7): 50-55. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.8.033.

[26] 左勇, 王小龍, 葉碧霞, 等. 基于高通量測(cè)序?qū)σ速e芽菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(10): 242-250. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.040.

[27] 董丹, 關(guān)統(tǒng)偉, 車振明, 等. 發(fā)酵初期豆瓣醬中微生物多樣性分析及產(chǎn)酶菌株的篩選[J]. 食品工業(yè), 2015, 36(7): 175-178.

[28] ABRUNHOSA L, INES A, RODRIGUES A I, et al. Biodegradation of ochratoxin A by Pediococcus parvulus isolated from Douro wines[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 188: 45-52. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.07.019.

[29] JORGE H G G, LUIS C D B, JUAN C C A, et al. Pediococcus damnosus strains isolated from a brewery environment carry the horA gene[J]. Institute of Brewing & Distilling, 2017, 123(1): 77-80.DOI:10.1002/jib.397.

[30] WALLING E, GINDREAU E, LONVAUD-FUNEL A.Exopolysaccharide biosynthesis by Pediococcus damnosus strains isolated from wine: elaboration of molecular detection tools[J]. Lait,2001, 81(1): 289-300. DOI:10.1051/lait:2001132.