文/張宸 陜西地建房地產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 陜西西安 710075 陜西省土地工程建設(shè)集團(tuán)有限責(zé)任公司 陜西西安 710075

1、前言

作為一項(xiàng)實(shí)際要求較高的實(shí)踐性工作，從枝菌根真菌在土地工程中的應(yīng)用有著其自身的特殊性。該項(xiàng)課題的研究，將會(huì)更好地提升對(duì)從枝菌根真菌在的分析與掌控力度，從而通過(guò)合理化的措施與途徑，進(jìn)一步優(yōu)化該項(xiàng)工作的最終整體效果。

2、概述

植物內(nèi)生真菌（endophytefungi）是非常重要的微生物資源，幾乎所有植物組織內(nèi)都存在內(nèi)生真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物具豐富的化學(xué)多樣性和廣泛的生物活性。自Strierle等發(fā)現(xiàn)紅豆杉的內(nèi)生真菌紫衫霉可產(chǎn)紫杉醇后，引發(fā)了利用內(nèi)生真菌來(lái)替代原植物的研究熱潮。很多植物中都發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)和宿主相同結(jié)構(gòu)的活性次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌，如白喉烏頭根部的內(nèi)生真菌芽枝狀枝孢（Cladosporiumcladosporioides）可產(chǎn)烏頭堿。為保護(hù)黃草烏野生植物資源，緩解我國(guó)中藥資源日益減少與需求量不斷增加之間的矛盾，本研究對(duì)黃草烏根部的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，為黃草烏的中藥資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

3、材料與方法

3.1 材料與試劑

黃草烏新鮮健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盤(pán)龍區(qū)，由昆明醫(yī)科大學(xué)楊淑達(dá)副教授鑒定，標(biāo)本（2015-yc-1）保存于云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院。葡萄糖、瓊脂粉、NaClO購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司，青霉素及卡那霉素購(gòu)于阿拉丁，酒精購(gòu)于天津化學(xué)試劑有限公司。

3.2 內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

3.2.1 分離培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g煮沸30min，加入葡萄糖20g，瓊脂粉12g，紗布過(guò)濾，濾液定容至1000mL，pH自然，121°C滅菌30min。

3.2.2 分離與培養(yǎng)黃草烏的根用自來(lái)水沖洗干凈，截成6～8cm長(zhǎng)條，晾干水分后于5%NaClO溶液漂洗60s，無(wú)菌水沖洗三次，然后于75%酒精漂洗60s，最后無(wú)菌水沖洗三次則表面消毒處理完畢。無(wú)菌狀態(tài)下將根切成2mm3小塊，置于分離平板培養(yǎng)基（28±1）°C靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)基需預(yù)先加入青霉素（100mg/L）和卡那霉素（100mg/L）以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。3～7d后培養(yǎng)基中可見(jiàn)菌落形成，挑取組織周圍的菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面。采用平板梯度稀釋法純化分得的內(nèi)生真菌，根據(jù)其主要菌落形態(tài)特征（菌落大小、顏色、表面特征和質(zhì)地）和菌體個(gè)體形態(tài)特征（菌絲、子實(shí)體和孢子形態(tài)），按微生物分類的不同將同一類群進(jìn)行歸類。最后將已純化和歸類的菌株分別轉(zhuǎn)入PDA斜面，在（28±1）°C下培養(yǎng)。

3.3 內(nèi)生真菌的鑒定

采用插片培養(yǎng)方法對(duì)分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀察、鑒定，在顯微鏡下觀察子實(shí)體特征，結(jié)合培養(yǎng)特性，將菌株鑒定到屬。然后依據(jù)不同屬的分類標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行種的鑒定。

3.4 分子生物學(xué)信息分析

在PDA平板上恒溫培養(yǎng)內(nèi)生真菌5d后在無(wú)菌條件下用刀片刮取菌絲至1.5mL離心管收集菌絲體。在研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，立即裝入1.5mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛』蚪MDNA后，用引物ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物交由昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)。

結(jié)果：

子囊菌門(mén)的菌株在綱、目、科、屬等分類水平上具有豐富的多樣性，分離鑒定的真菌包括子囊菌門(mén)的4綱、7目、9科、16屬，其中地絲霉屬（Geomyces）和漆斑菌屬（Myrothecium）在科的水平上未分類。屬于接合菌門(mén)的菌株僅有4株2種，都為接合菌綱毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌屬。另外有4株3種的真菌屬于擔(dān)子菌門(mén)，分布于擔(dān)子菌門(mén)的1綱、2目、3科、3屬中。在綱的分類水平上，糞殼菌綱有24株，占分離總數(shù)的46.2%，包括10屬13種。其次為散囊菌綱，有15株，包括2屬12種。在目的分類水平上，優(yōu)勢(shì)目為肉座菌目，具有18株9種的內(nèi)生真菌，其次為散囊菌目，有15株12種。叢赤殼科和發(fā)菌科為黃草烏的優(yōu)勢(shì)菌群，分別有14株6種和15株12種。從屬的層面上看，鐮刀菌屬共分離得到12株4種，是黃草烏內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬種；其次是青霉菌屬，有11株9種，曲霉屬有4株3種。

討論：

本研究所得黃草烏根部的內(nèi)生真菌類群普遍被認(rèn)為腐生性較強(qiáng)，但是所采集的樣本全部來(lái)自健康植株，宿主未表現(xiàn)受到傷害或感染病害的癥狀，應(yīng)該不會(huì)給腐生性真菌提供生長(zhǎng)基質(zhì)。因此認(rèn)為這些真菌是內(nèi)生的或至少是部分內(nèi)生且不引起植物病害，它們符合植物內(nèi)生真菌的有關(guān)定義。本研究還發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬是黃草烏根部?jī)?nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬種，在本實(shí)驗(yàn)中分離得到的4種鐮刀菌屬的真菌：腐皮鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、三隔鐮刀菌、尖孢鐮刀菌均被報(bào)道能引起植物病害，可以認(rèn)為是潛伏的致病菌。本研究中亦從黃草烏中分離得到芽枝狀枝孢，該菌曾被報(bào)道可產(chǎn)生二萜生物堿類化合物烏頭堿，本研究所分離得到的芽枝狀枝孢是否能在一定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生二萜生物堿則有待進(jìn)一步研究。

結(jié)語(yǔ)：

綜上所述，加強(qiáng)對(duì)從枝菌根真菌在土地工程中應(yīng)用的研究，對(duì)于其良好實(shí)踐效果的取得有著十分重要的意義，因此在今后的從枝菌根真菌應(yīng)用工作過(guò)程中，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)其關(guān)鍵環(huán)節(jié)與重點(diǎn)要素的重視程度，并注重其具體實(shí)施措施與方法的科學(xué)性。