竇曉霞，王家敏，李 倬

(1.西北民族大學 甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

流感即流行性感冒(Influenza)，是由流感病毒(Influenza virus)引起的一種急性呼吸道傳染性疾病.據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)，每年有300萬～500萬人嚴重感染流感，造成25萬～50萬人死亡[1].已有的抗病毒藥物對于流感病毒有一定的控制作用，但由于耐藥性的產(chǎn)生，流感沒有得到有效控制.目前，接種疫苗仍是預防流感最有效、最經(jīng)濟的方法.流感疫苗以雞胚培養(yǎng)法生產(chǎn)的傳統(tǒng)疫苗為主，近年來流感的新型基因工程疫苗和基于哺乳動物細胞培養(yǎng)的疫苗都有突破性進展，部分已應(yīng)用于臨床.本文就流感疫苗的研究進展進行概述.

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗1940年開始生產(chǎn)和使用，是最常見的流感疫苗[2]，主要有三類：①全病毒滅活疫苗，1954年首先在美國批準生產(chǎn)，含有完整的已滅活的流感病毒，包含病毒所有的蛋白質(zhì)、脂類和核酸.無論是血凝素(hemagglutinin HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase NA)基因還是病毒的內(nèi)源性蛋白，都會誘發(fā)免疫反應(yīng)而產(chǎn)生各自相對應(yīng)的抗體[3]，其免疫原性強，但副作用大，只推薦成人使用[4].②裂解疫苗：對滅活完整病毒加以裂解并去除核酸和大分子蛋白，只保留其抗原有效成分HA和NA以及部分基質(zhì)蛋白和核蛋白后制成[5]，因其不含脂質(zhì)而副反應(yīng)小且免疫原性強，可用于兒童和老年人.③亞單位疫苗：由裂解疫苗進一步裂解純化制成，由于其只包含了流感病毒的免疫原性與致病性相關(guān)的HA和NA抗原，因此安全性良好[6]，可適用于所有人.董蒲梅等[7]比較了給6～12歲兒童接種流感亞單位疫苗和裂解疫苗的安全性和免疫原性，發(fā)現(xiàn)兩種疫苗的免疫學效果相似，安全性良好，且亞單位疫苗發(fā)熱反應(yīng)率低于裂解疫苗.

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是將病毒在人工培育條件下使其喪失大部分反應(yīng)原性，保留免疫原性制成.接種這類疫苗能引發(fā)機體產(chǎn)生持久的粘膜免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答以及細胞免疫應(yīng)答[2].這種疫苗在俄羅斯使用了數(shù)十年，2003年在美國獲得批準使用，用于2歲兒童到49歲成人之間[8]，2012年在歐洲獲得批準使用，用于年齡為2歲～17歲的兒童[2].但是，2017～2018年的季節(jié)性流感不推薦兒童使用[9].美國Medimmune公司于2003年成功研發(fā)了全球第一支三價流感病毒活疫苗FluMist并上市，通過十余年的臨床應(yīng)用，證明流感病毒減毒活疫苗是安全的[10].

2 新型疫苗

2.1 類病毒顆粒疫苗

流感病毒血清型眾多，給流感疫苗的研發(fā)帶來了巨大的困難，類病毒顆粒(virus-like particles，VLPs)疫苗為這一難題提供了解決辦法.VLPs是含有某種病毒一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，類似于完整的病毒粒子，具有與完整病毒相似的免疫原性、不含病毒核酸物質(zhì)，可誘導產(chǎn)生免疫應(yīng)答但不能自主復制且不具有感染性[11]，是一種理想的疫苗形式.流感類病毒顆粒疫苗是將流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因插入到表達載體中，再轉(zhuǎn)入原核或真核細胞中進行表達.2013年，美國(FDA)批準了由Sciences公司生產(chǎn)的昆蟲桿狀病毒表達的三價流感疫苗Flublock上市[12]，2016 年該公司再次宣布Flublok 四價流感疫苗被批準用于18歲以上成年人，并且在Ⅰ～Ⅳ臨床期試驗中顯示了良好的免疫原性和安全性[13].

2.2 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是選擇不能復制或者能復制但不致病的病毒作為載體，其利用基因工程的方法將流感抗原基因重組到病毒基因序列中，構(gòu)建重組病毒[14]制成的疫苗.該疫苗能夠模仿病原體自然感的方式進入機體.在重組病毒進入機體后，流感抗原基因隨著病毒的復制而高效表達，誘導機體產(chǎn)生針對抗原蛋白全面、有效、持久的免疫應(yīng)答.荷蘭伊拉斯謨醫(yī)學中心的A Hessel等研究了改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara ，MVA )為載體的H5N1的HA重組疫苗的保護性，發(fā)現(xiàn)用3×108pfu MVA-HA-Vietnam/04免疫兩次后，用同源A/Vietnam/1194/04和異源A/Indonesia/5/05毒株攻毒，疫苗均能提供保護[15].

2.3 病毒核酸疫苗

2.3.1 DNA疫苗

DNA 疫苗即用基因工程的方法把一個或幾個抗原蛋白的編碼基因克隆到真核表達載體上，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入機體內(nèi)，使編碼基因借助宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制獲得表達而得到抗原蛋白，進而通過抗原提呈細胞將抗原提呈給免疫細胞，激活機體特異性的細胞和體液免疫反應(yīng)[5].洪宇[16]設(shè)計并合成了亞型H3579抗A型多表位DNA流感疫苗H5HA-Epi-H7HA-1-p VAX，進行免疫指標檢測.結(jié)果表明，HA結(jié)合抗原表位完整DNA疫苗，具有應(yīng)對目前出現(xiàn)的亞型流感的潛力.陳銳等[17]通過將重配質(zhì)粒與流感病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS-1細胞和MDCK細胞的混合液中，篩選出拯救H7N9流感疫苗病毒候選株rg PR8-H7N9，并證明了以該候選株制備的H7N9流感裂解疫苗具有良好的免疫原性與免疫保護性.

2.3.2 mRNA疫苗

mRNA疫苗與DNA疫苗的作用機制相似，但相比于DNA疫苗而言，mRNA 疫苗在接種到機體后，直接被翻譯轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)，因此，表達的抗原蛋白量更高，降低了疫苗接種量和病毒核酸序列整合到宿主基因組的風險.但mRNA疫苗的缺陷是mRNA容易被RNA酶降解，Petsch等通過優(yōu)化mRNA疫苗的GC含量和UTR序列，再將其整合到核酸精蛋白上，從而使mRNA免受RNase的降解，提高了其穩(wěn)定性[18].

2.4 廣譜疫苗

廣譜疫苗是對流感病毒的不同亞型的流感病毒產(chǎn)生交叉免疫保護，從而保護機體免受多種亞型流感病毒的感染的疫苗.流感病毒屬于正粘病毒科，由8個節(jié)段基因表達的 10 種蛋白組成，包括HA、NA、跨膜蛋白(membrane-spanning protein 2，M2)、基質(zhì)蛋白1(matrix protein 1，M1)、核蛋白(nucleocapsid protein，NP)、RNA 聚合酶 PA、PB1、PB2 及非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1、NS2[19].目前，對廣譜流感疫苗的研究主要針對的保守表位，主要有以下幾種：

1)HA1：HA在靶細胞內(nèi)以前體的形式被合成(HA0)后酶切得到HA1和HA2兩個結(jié)構(gòu)域.HA1主要構(gòu)成HA的頭部，HA2和HA1的一小部分構(gòu)成HA的莖部[20].中和抗體識別的優(yōu)勢抗原表位主要位于HA頭部.因此，目前廣泛使用的三價流感疫苗所誘導的抗體都是針對HA頭部，盡管病毒可以通過改變HA1上的糖基化修飾位點或者積累點突變來掩飾或者改變抗體識別表位，從而逃脫抗體的中和作用[21].但頭部的改變只是改變病毒的致病性和病原性，且頭部唾液酸受體區(qū)為保守區(qū)，能產(chǎn)生具有交叉保護作用的抗體.所以，基于HA1的廣譜流感疫苗的研究對于預防不同亞型的流感具有一定的意義.

2)HA2：HA2抗體的結(jié)合位點是HA2蛋白N末端的23個氨基酸，被稱作融合肽( Fusion peptide，F(xiàn)P)，是一段高度保守區(qū)域.該區(qū)域可阻止流感病毒與細胞融合、HA 的裂解以及病毒釋放，并可誘導產(chǎn)生ADCC及補體依賴細胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC).此處受到攻擊會使流感病毒不能存活[19].針對HA2的廣譜流感疫苗的主要設(shè)計方法是，去除HA的HA1部分，只保留HA1 蛋白的N、C末端及HA2蛋白.將該無頭HA2蛋白以VLPs的形式表達或者輔以合適的佐劑改善HA2蛋白的免疫原性，提高免疫保護效果[22].CHEN等[23]構(gòu)建和表達了構(gòu)型正確、穩(wěn)定的無HA1的HA，用其免疫小鼠和雪貂后，可誘導產(chǎn)生廣譜的中和抗體.

3)NP和M1：NP和M1蛋白均高度保守，這兩種蛋白不會暴露在病毒表面，也不會在細胞表面表達，所以可以誘導細胞免疫反應(yīng).其誘導的T細胞免疫有廣泛交叉保護作用.針對NP和M1蛋白的疫苗主要為病毒或載體疫苗.如Dynavax公司[24]利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達了流感毒A/P/R/8/34(H1N1)的NP蛋白的新型流感疫苗，LILLIE等利用改良型痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia virus Ankara，MVA)為載體構(gòu)建了含 NP和M1新型流感疫苗[19].

4)M2e：M2e存在于膜內(nèi)蛋白M2的N端，是一段由24個N-末端殘基組成的高度保守序列.基于M2e蛋白的流感疫苗免疫性低，還需要借助如構(gòu)建表達M2e的VLPs、與免疫原性較強的大分子蛋白融合表達以及添加合適的佐劑等來增強M2e免疫原性，如De Filette等[25]將酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白GCN4(general control nondepressible 4)四聚體與M2e融合形成M2e-GCN4四聚融合體，接種小鼠后，小鼠在致死攻毒劑量情況下，100%被攻毒的小鼠均得到免疫保護而存活.

5)NA：NA是流感病毒表面的另一種重要糖蛋白，因其有水解唾液酸的作用，故對病毒從宿主細胞中釋放有重要作用，所誘導的抗體也具有交叉保護作用.但是NA誘導的免疫反應(yīng)能夠減緩病毒感染子代細胞并且能減輕感染后的嚴重程度[20].要加強其免疫效果需通過病毒載體表達多亞型NA或者構(gòu)建融合NA的VLPs，如EASTERBROOK[26]等用H1N1毒株的NA基因序列制備出了NA病毒樣顆粒疫苗，用其免疫小鼠后，其對H5N1病毒也產(chǎn)生了交叉免疫.

3 基于哺乳動物細胞生產(chǎn)的流感疫苗

目前，國內(nèi)外使用的流感疫苗大多是雞胚疫苗.這種疫苗傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝固然成熟，但還存在很多缺陷，如成本高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、勞動強度大、生產(chǎn)周期長、病毒容易變異、易引起過敏反應(yīng)等.因此，WHO于1995年提出使用哺乳動物細胞替代雞胚作為流感疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)[27].現(xiàn)階段獲得批準可用于人用流感疫苗生產(chǎn)的細胞系主要有Vero細胞、MDCK細胞和PER.C6細胞.其中，Vero細胞在全球獲得批準使用，MDCK細胞僅在歐洲獲得批準[28]，PER.C6細胞系存在專利保護問題，無法推廣[29].目前，應(yīng)用最廣的細胞系為Vero細胞和MDCK細胞.Baxter公司有三種Vero細胞生產(chǎn)的滅活流感疫苗上市，分別為三價滅活疫苗Preflucel，單價A(H5N1)流感大流行滅活疫苗Vepacel，單價A(H1N1)(PDM 09)流感大流行滅活疫苗Celtura[30].但是，目前基于Vero細胞生產(chǎn)疫苗的細胞系，存在可能檢測不出的潛在感染性因子和殘余宿主蛋白和以及DNA可能導致致瘤性和致癌性的風險[31].

劉鵬等[32]通過流感病毒在Vero細胞系與MDCK細胞系增殖條件中的比較，結(jié)果表明，流感病毒血凝素在MDCK細胞系可獲得較高的滴度.目前已上市的基于MDCK細胞生產(chǎn)的流感疫苗Novartis公司生產(chǎn)的疫苗，Optaflu，Novartis公司在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)的甲型H1N1疫苗Celtura[29].Solvay Pharmaceuticals公司生產(chǎn)的季節(jié)性亞單位流感疫苗Influvac，Med Immune公司生產(chǎn)的四價流感疫苗FluMist.

4 結(jié)語

目前，流感嚴重威脅著我國乃至世界的人類健康和公共衛(wèi)生安全，對流感的防治已經(jīng)刻不容緩.雖然流感病毒是目前研究比較清楚的一類病毒，但是由于其極易產(chǎn)生抗藥性、易發(fā)生變異等特性，且由于目前使用的疫苗只能對亞型內(nèi)的毒株產(chǎn)生抗體，又因其生產(chǎn)基質(zhì)都是雞胚，無疑增加了潛在支原體等污染，這對于預防流感以及流感疫苗的開發(fā)是嚴峻的考驗.面對日趨嚴重的流感大流行，開發(fā)安全有效、抗原含量單一、能預防多種亞型流感病毒以及能產(chǎn)生持久的保護作用的疫苗成為科研的重點.一些新型疫苗的研究為有效預防流感帶來希望.隨著對流感致病機理研究的深入以及分子生物學的不斷發(fā)展，研制出快速有效、致敏性低的新型流感疫苗有望實現(xiàn).

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