乳及乳制品中卡那霉素殘留快速檢測產(chǎn)品應(yīng)用

李研東+熊雅婷+李云

1 卡那霉素的檢測現(xiàn)狀

卡那霉素（Kanamycin）是一種氨基糖苷類抗生素，具有很強(qiáng)的抑菌作用，因價格低廉且抗菌性廣，而作為獸藥被廣泛使用。然而，在動物實(shí)際養(yǎng)殖過程中，濫用卡那霉素的現(xiàn)象屢見不鮮，造成其在動物源性食品中存在殘留，尤其是在乳品中的殘留現(xiàn)象更為嚴(yán)重。過量的卡那霉素可給人體帶來嚴(yán)重的副作用，主要包括腎毒性、造血系統(tǒng)毒性、過敏性等。另外，卡那霉素對嬰幼兒有很強(qiáng)的耳毒性，會導(dǎo)致嬰幼兒耳蝸細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重者會造成聽力喪失。因此，嚴(yán)格控制卡那霉素在乳品中的殘留對保障乳品安全，維護(hù)消費(fèi)者健康意義重大。

由于我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部公告第235號）發(fā)布時間較早，所以公告中并未規(guī)定卡那霉素的限量要求。參照歐盟獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，卡那霉素在乳品中的最高殘留限量為150μg/kg，因此可預(yù)測我國的獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)修訂會參考?xì)W盟的限量標(biāo)準(zhǔn)對卡那霉素限量進(jìn)行嚴(yán)格把控。目前，檢測卡那霉素藥物殘留最普遍的方法為實(shí)驗(yàn)室檢測方法，即儀器方法，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）等。雖然此類檢測方法靈敏度高，但操作復(fù)雜，耗時較長，價格昂貴，因此也限制了其在現(xiàn)場實(shí)際的應(yīng)用，故建立一種快速、靈敏、便捷的食品中卡那霉素的檢測方法對于保障食品安全很有必要。

北京維德維康生物技術(shù)有限公司（以下簡稱“維德維康”）基于前期深厚的研發(fā)基礎(chǔ)，研制出一系列卡那霉素快速檢測產(chǎn)品，包括卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒、卡那霉素膠體金快速檢測試紙條等產(chǎn)品，可實(shí)現(xiàn)生鮮乳、原奶、奶粉、成品奶等多種質(zhì)地乳品產(chǎn)品的快速定量、定性檢測，覆蓋乳品生產(chǎn)加工全產(chǎn)業(yè)鏈，可滿足多層次用戶的檢測需求。其中膠體金快速檢測試紙條操作簡單、檢測速度快，5min即可判讀檢測結(jié)果；酶聯(lián)免疫試劑盒反應(yīng)靈敏，檢測限低至0.3μg/kg，達(dá)到行業(yè)領(lǐng)先技術(shù)水平。

2 卡那霉素酶聯(lián)免疫檢測體系

2.1 卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理

酶聯(lián)免疫吸附測定法是將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入底物顯色，顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就可將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

維德維康基于酶聯(lián)免疫吸附測定法的原理，研制了卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒，用于快速檢測乳品中卡那霉素藥物殘留。檢測樣品中的卡那霉素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)記物，催化底物顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中卡那霉素的含量：顯色深，含量少；顯色淺，含量多。

2.2 卡那霉素酶聯(lián)免疫檢測體系的組成

卡那霉素酶聯(lián)免疫檢測體系由卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒和酶標(biāo)儀兩部分組成，酶聯(lián)免疫試劑盒具有配套的96孔酶標(biāo)板，板內(nèi)包被維德維康自主研發(fā)的卡那霉素抗原物質(zhì)，可與卡那霉素抗體特異性結(jié)合，敏感性強(qiáng)；試劑盒內(nèi)配有酶標(biāo)記物工作液，通過催化作用使底物顯色，根據(jù)顯色深淺可進(jìn)行定量檢測。酶標(biāo)儀中內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，可讀取定量檢測結(jié)果。

2.3 卡那霉素酶聯(lián)免疫檢測體系的優(yōu)點(diǎn)

2.3.1 樣本前處理簡單快速：稱取1g乳制品樣本于離心管中；加入1mL 1%的三氯乙酸，震蕩離心5min；取50μL中間層清液于2mL離心管中；加入950μL樣品稀釋液，充分混勻；待測。

2.3.2 “一步法”檢測步驟：將板條插入酶標(biāo)板架上，依次加入50μL樣品溶液、酶標(biāo)記物工作液和抗體工作液；避光反應(yīng)30min；充分洗滌，立即加入100μL底物溶液，避光反應(yīng)15min；終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值，即可得出定量檢測結(jié)果。

2.3.3 檢測結(jié)果準(zhǔn)確：隨機(jī)選取3批卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，試劑盒在生鮮乳、原奶、奶粉、成品奶等多種類型樣本中的檢測限均可達(dá)到10μg/kg，添加回收率為70%～118%，批內(nèi)批間變異系數(shù)均不超過10%。以《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測結(jié)果作為認(rèn)定值，與卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果相比較，結(jié)果顯示，兩種方法的符合率達(dá)到99.5%以上，符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測范圍。

3 卡那霉素膠體金免疫層析

快速檢測體系

3.1 卡那霉素膠體金免疫層析快速檢測體系原理

利用間接競爭原理，待測物和T線標(biāo)記的抗原共同競爭金標(biāo)抗體，根據(jù)膠體金試紙T線的顯色情況，來定性判斷待測樣品中是否含有目標(biāo)化合物。檢測試紙條含有被事先固定于硝酸纖維素膜上的測試區(qū)（T）的抗原和控制區(qū)（C）的Ⅱ抗。微孔中的金標(biāo)抗體經(jīng)奶樣溶解后，50℃孵育3min，將試紙條插入金標(biāo)微孔中反應(yīng)5min，根據(jù)T區(qū)、C區(qū)的顏色深淺對比判讀結(jié)果。

3.2 卡那霉素膠體金免疫層析快速檢測體系的組成

卡那霉素膠體金免疫層析快速檢測體系由卡那霉素試紙條、金標(biāo)微孔和孵育器3部分組成，試紙條上具有檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），分別固定有抗原和Ⅱ抗，能夠特異性結(jié)合金標(biāo)抗體，靈敏度高；金標(biāo)微孔內(nèi)裝有膠體金標(biāo)記的抗體；孵育器為保溫裝置，可促進(jìn)樣本溶液流動并控制合適的反應(yīng)溫度。各部分組成如圖1所示。

3.3 卡那霉素膠體金免疫層析快速檢測體系的優(yōu)點(diǎn)

3.3.1 前處理簡單：膠體金免疫層析體系無需復(fù)雜的前處理，對于生鮮乳、原奶、成品奶等液態(tài)產(chǎn)品，只需充分搖勻即可檢測；對于奶粉等樣本，用去離子水溶解后也可直接檢測。

3.3.2 操作簡單：檢測時，吸取200μL奶樣于金標(biāo)微孔中，小心吹打至紫紅色顆粒溶解，置于50℃孵育器內(nèi)孵育3min，將試紙條插入金標(biāo)微孔中，反應(yīng)5min，取出試紙條即可判定檢測結(jié)果。全程檢測在10min內(nèi)完成，反應(yīng)時間快；無需額外有機(jī)化學(xué)試劑，綠色環(huán)保無污染；操作簡單，無需專業(yè)培訓(xùn)，適合基層檢測單位、質(zhì)監(jiān)部門現(xiàn)場快速監(jiān)測及企業(yè)常規(guī)質(zhì)檢。

3.3.3 判讀精確：對于原奶和奶粉樣本，卡那霉素快速檢測試紙條檢測限可達(dá)到3μg/kg，與目前歐盟獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定的限量值（150μg/kg）相比，靈敏度更高。同時，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該產(chǎn)品的假陽性率可控制在3%以內(nèi)，假陰性率低于1%；能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確判讀。

3.3.4 包裝小巧，便于攜帶：試紙條采用封閉包裝，可有效避免環(huán)境中污染物質(zhì)污染試紙條，影響檢測結(jié)果。試紙條保存溫度在20±5℃之間，即開即用，且有效期為12個月，適用于車間、市場、養(yǎng)殖場等多種檢測環(huán)境，能夠滿足一線檢測的需求。

4 結(jié)論

卡那霉素快速檢測系統(tǒng)，包括卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒、卡那霉素膠體金快速檢測試紙條等產(chǎn)品均具有檢測準(zhǔn)確度高、操作簡單、便于攜帶的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)生鮮乳、原奶、奶粉等多種乳及乳制品中卡那霉素殘留的快速檢測，填補(bǔ)了國內(nèi)卡那霉素快速檢測的空白，防止卡那霉素殘留超標(biāo)產(chǎn)品上市對消費(fèi)者造成危害。同時，卡那霉素快速檢測系統(tǒng)的使用和推廣將有效提升各應(yīng)用地區(qū)的乳品檢測技術(shù)手水平，切實(shí)解決一線檢測單位及生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)費(fèi)不足、專業(yè)性差的問題，滿足各級質(zhì)檢單位、乳品生產(chǎn)加工企業(yè)的檢測需求，促進(jìn)乳品產(chǎn)業(yè)鏈向著健康安全的方向發(fā)展。endprint