梁新合，王 會，金 平，張 輝，孫佳明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

烏梢蛇為游蛇科烏梢蛇（Zaocys dhumnades）的干燥全體，無毒，別名烏風(fēng)蛇、烏蛇、青蛇、黑烏梢等。烏梢蛇性味甘、平，歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)、活絡(luò)、止驚的功效；臨床上用于風(fēng)濕頑痹，麻木拘攣，中風(fēng)口眼喁斜，抽搐痙攣，破傷風(fēng)，麻風(fēng)，疥癬等疾病的治療[1]。但是由于大量的獵殺捕捉，造成了中藥資源的嚴(yán)重短缺，其價(jià)格也顯著上漲，從而引起一些不良商販利用其他廉價(jià)蛇種進(jìn)行偽造，對國內(nèi)烏梢蛇藥材市場產(chǎn)生很大影響，所以鑒別技術(shù)的發(fā)展及改進(jìn)有待進(jìn)行。因此新技術(shù)如PCR法、DNA快速提取法、電泳法等開發(fā)與利用已經(jīng)成為熱門課題，得到高度的重視。

1 傳統(tǒng)的鑒別技術(shù)

1.1 形狀鑒別 烏梢蛇，為游蛇科動物烏梢蛇除去內(nèi)臟的全體，生存于海拔1600 m以下的中低山地帶，常在農(nóng)田、河溝附近出現(xiàn)。其體形較大，無毒，蛇體全長2.5 m以上，一般雌蛇較短，眼睛較大，鼻孔大而橢圓，位于兩鼻鱗之間；上唇鱗有8枚，其4、5枚入眼，下唇鱗9～11枚，第6枚最大；頰鱗低矮，1枚，眼前鱗1枚，上緣包至頭背，顳鱗前后各2枚；背鱗前段16行，后段14行，背脊中央2～4行起棱；腹鱗186～205枚，尾下鱗105～ 128枚，肛鱗2枚；體呈青灰褐色，各鱗片的邊緣呈黑褐色；背中央的2行鱗片呈黃色或黃褐色，其外側(cè)的2行鱗片則成黑色；上唇及喉部淡黃色，腹面灰白色，其后半部呈青灰色。此法不適用于烘干、熏蒸、切片等處理的中藥材鑒別[2]。

1.2 顯微鑒別 其方法是采用電子掃描顯微鏡觀察，如果出現(xiàn)烏梢蛇背脊鱗增厚并表面有棱脊，紋飾呈橫向渡狀排列且為彎曲不直的條帶紋，條帶紋同向排列緊密，還有如滴水狀的刺尖端的特征，即為真品，反之無此特征者即為偽品。楊小平等[3]通過光學(xué)顯微及掃描電鏡鑒別對烏梢蛇及其偽品玉斑錦蛇、灰鼠蛇、水赤鏈游蛇的鱗進(jìn)行了研究，結(jié)果表明偽品蛇鱗片的特征與真品雖有相似處，但形狀、顏色、紋理的細(xì)微結(jié)構(gòu)在掃描電鏡下有顯著差異，紋飾的結(jié)構(gòu)可為真?zhèn)螢跎疑哞b別的提供可靠的依據(jù)。此方法適用于樣品為碎段或無正品對照時(shí)，為鑒別提供參考依據(jù)。

1.3 色譜法鑒別 熊學(xué)敏等[4]采用薄層色譜法對純蛇粉膠囊中的主要成分烏梢蛇進(jìn)行定性鑒別，其操作簡便，穩(wěn)定性好也可重復(fù)操作，可作為鑒別該膠囊有效成分的方法；該方法采用了中藥小白花蛇、地龍、蘄蛇和空白對照反復(fù)比較，均未檢出可鑒別該膠囊主成分烏梢蛇的色譜斑點(diǎn)，因此，該方法具有定性檢驗(yàn)的鑒別意義以及為質(zhì)量控制提供依據(jù)。但方法也有局限性，其表現(xiàn)在當(dāng)無對照品時(shí)，難以鑒別。黃文琦課題組通過以烏梢蛇主成分氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用HPLC建立16個(gè)共有特征吸收峰的指紋圖譜[5]。此方法為部分摻假的偽藥提供準(zhǔn)確的鑒別依據(jù)。此外，有研究通過對烏梢蛇及紅點(diǎn)錦蛇石油醚浸出物紫外最大波長檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者最大吸收波長接近，但結(jié)合紫外光譜圖來看，兩者具有顯著差別，并且該結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

2 現(xiàn)代鑒定技術(shù)

2.1 基于PCR技術(shù)，開發(fā)一系列高效、準(zhǔn)確的分子水平的鑒別方法 由于傳統(tǒng)的鑒別技術(shù)性狀、顯微、色譜法以及經(jīng)典的PCR[6]技術(shù)鑒別項(xiàng)還不夠完善，難以準(zhǔn)確的鑒別烏梢蛇的真?zhèn)?。為了獲得一種快速、準(zhǔn)確、有效的鑒別蛇類真?zhèn)蔚姆椒?，陳康等[7]通過對經(jīng)典 PCR技術(shù)方法條件進(jìn)行優(yōu)化，并且結(jié)合 DNA快速提取技術(shù)[8-9]和熒光檢測技術(shù)[10-11]將藥典中蛇類（烏梢蛇、金錢花白蛇、蘄蛇等）鑒別時(shí)間縮短為30 min左右，大大加快了中藥材的鑒別效率，同時(shí)也為真?zhèn)舞b定試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。在臨床檢驗(yàn)和司法檢中也將產(chǎn)生重大影響[12-14]?？紤]到PCR方法中提取烏梢蛇 DNA要求準(zhǔn)確、簡便，且影響鑒別因素諸多，引起專家、學(xué)者們的研究熱情，如唐曉晶等[15]通過選取烏梢蛇及其他10種常見混淆品，利用它們線粒體中的12 srRNA基因序列，設(shè)計(jì)一對專屬于烏梢蛇鑒別的引物 HWL-1和 HWH-1，其原理是利用不同復(fù)性溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到相應(yīng)特異性反應(yīng)條帶，有且只有正品有良好的反應(yīng)條帶。因此利用此方法對市場上購買的各種混淆品進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明：在65 ℃復(fù)性溫度下，正品烏梢蛇在約320 bp處出現(xiàn)陽性擴(kuò)增帶，而混淆品在相同的條件下無擴(kuò)增帶。此設(shè)計(jì)的鑒別引物對正品烏梢蛇具有高度的特異性，對于經(jīng)過醋炙的烏梢蛇段，已經(jīng)失去個(gè)體的完整性，能很好的克服這個(gè)弊端，并且此方法簡單、精確、靈敏、效率高、重現(xiàn)性好具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

此外，孫清萍等[16]鑒于常用的PCR技術(shù)需求的條件高、步驟多、時(shí)間長難以實(shí)現(xiàn)快速檢測，為了加快效率，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplifi cation，LAMP）開發(fā)一套快速篩查烏梢蛇正品的方法。其過程主要是：通過以烏梢蛇12srRNA基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并篩選出1套LAMP引物，實(shí)現(xiàn)烏梢蛇的LAMP特異性擴(kuò)增，而其他蛇類沒有明顯變化。但是其實(shí)是在DNA快速提取[17-18]的基礎(chǔ)上運(yùn)用LAMP進(jìn)行快速篩選這與PCR技術(shù)第一步相同，只是后續(xù)步驟不一樣，而到達(dá)高效的要求，實(shí)現(xiàn)分子水平對中藥材的篩選鑒別。其在有DNA的存留的中藥材、食品等篩選鑒別中有顯著的應(yīng)用價(jià)值。

李梓僮等[19]應(yīng)用現(xiàn)代DNA 指紋技術(shù)，即通過對2015 年版《中國藥典》烏梢蛇DNA檢測方法[20]進(jìn)行了優(yōu)化和改良，研制了烏梢蛇DNA提取和檢測試劑，開發(fā)了烏梢蛇 PCR檢測試劑盒；該實(shí)驗(yàn)用試劑盒法提取的DNA樣品，經(jīng)特異引物PCR擴(kuò)增后，正品烏梢蛇DNA與引物有特異性結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物約為 300 ～ 400 bp，偽品均無擴(kuò)增條帶。并與中國食品藥品檢定研究院用藥典方法得到的結(jié)果完全一致。此項(xiàng)研發(fā)優(yōu)化了PCR技術(shù)的操作步驟，使原本反復(fù)的配制試劑過程變得簡單，最大程度減少了鑒別者的工作量，縮短了鑒別時(shí)間周期，降低了由于實(shí)驗(yàn)人員操作造成的DNA污染的可能性更多的可以廣泛地應(yīng)用到藥品檢驗(yàn)的基層單位。

2.2 基于化學(xué)成分分析，高效毛細(xì)管電泳技術(shù)的應(yīng)用 另外一種從化學(xué)成分角度考慮的鑒別技術(shù)就是高效毛細(xì)管電泳（HPCE）。對于烏梢蛇化學(xué)成分許多學(xué)者都有研究，鄭艷青等[21]對烏梢蛇化學(xué)成分進(jìn)行了總結(jié)，其主要成分中氨基酸包括：天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（ser）等；無機(jī)元素：鈣、銅、鐵、鉀、鎂等；其他成分：蛋白質(zhì)、脂肪、果糖-l，6-二磷酸醋酶、蛇肌醛縮酶以及膠原蛋白。

電泳法是目前鑒別中藥材特別是動物藥的首選方法。李峰等[22]通過采用HPCE技術(shù)，對10批選自不同產(chǎn)地的烏梢蛇藥材進(jìn)行指紋圖譜研究。通過優(yōu)化試驗(yàn)條件（參照物的選擇、電泳條件選擇）使其HPCE圖譜在30 min內(nèi)完全分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們只有 7 個(gè)共有峰，即將其作為鑒別烏梢蛇的特征指紋峰。將這10批藥材通過與共有模式對比，結(jié)果顯示其相似度為0.86～0.99，方法學(xué)考察符合要求，因此說明該方法具有良好的精密度和分離效果，可作為烏梢蛇藥材質(zhì)量評價(jià)的有效方法。但各樣品共有峰為哪種成分不能確認(rèn)。因此，其實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果只能說明動物藥材存在成分及含量不同，不能明確判定各藥材商品質(zhì)量的優(yōu)劣。肖寄平等[23]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳針對一些死亡動物肢體未降解蛋白復(fù)合占有比例差別鑒別烏梢蛇與其他蛇類。但需要注意的是蛋白樣品提取條件需要較嚴(yán)格。

3 小結(jié)

綜上所述，隨著科技的發(fā)展，技術(shù)都在更新，以往的烏梢蛇真?zhèn)舞b別技術(shù)也由傳統(tǒng)性狀鑒別、鱗被與骨骼鑒別、顯微鑒別、理化鑒別發(fā)展到經(jīng)過優(yōu)化的PCR技術(shù)鑒別、高效毛細(xì)管電泳技術(shù)等，對中藥材中出現(xiàn)的一些漏洞進(jìn)行彌補(bǔ)。2015 年版《中國藥典》在測量定項(xiàng)尚無收載，故很難實(shí)現(xiàn)對不完全摻偽、摻雜蛇類中藥的鑒別。所以還需要重視藥用活性成分與藥效學(xué)的研究，探尋更合適的鑒別和質(zhì)量控制方法，也期待著一些新技術(shù)的開發(fā)運(yùn)用，將逐步引導(dǎo)烏梢蛇的真?zhèn)舞b別向高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的方向發(fā)展。

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