烏梢蛇PCR快檢試劑盒的應(yīng)用與評價

楊志業(yè)1 方 竑1 譚穎儀1 劉 昂1 趙玉洋 袁 媛

1.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700

烏梢蛇首載于南北朝《雷公炮炙論》[1-2]，其后歷代本草多有記載，尤以明代李時珍《本草綱目》的記載最為詳盡，在我國已有幾千年的藥用歷史。歷版藥典規(guī)定烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇ZaocysdhumnadesCantor 除去內(nèi)臟的干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。在現(xiàn)代臨床上，烏梢蛇廣泛用于治療皮膚瘙癢癥、白癜風(fēng)、牛皮癬等，如烏蛇止癢丸、白癜風(fēng)丸等[3]。烏梢蛇養(yǎng)殖成本較高，其商品主要為野生。隨著野生動物保護(hù)力度的進(jìn)一步加強(qiáng)，烏梢蛇市場資源短缺，價格顯著上漲，為了牟取暴利，市場上出現(xiàn)了多種烏梢蛇偽品或混淆品[4]。

傳統(tǒng)鑒別方法多以蛇頭、腹鱗、體背鱗、肛鱗及尾下鱗的特征作為主要鑒別點[5]，但專業(yè)性要求高，而且經(jīng)去頭及鱗片后切制或酒制等炮制加工的飲片，鑒別難度大，無法滿足對市售烏梢蛇質(zhì)量控制的要求。中國藥典自2010年版始收載了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測法對烏梢蛇進(jìn)行鑒別，該法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合更為準(zhǔn)確、可靠[6-9]。但經(jīng)典PCR法對實驗環(huán)境、操作人員要求高，常規(guī)裂解過程耗時長、步驟多，至少需要3.5 h才能完成單次檢驗，無法適應(yīng)當(dāng)前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場運用的需要。為了獲得一種快速、準(zhǔn)確、高效的鑒別烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?，陳康等[10]通過對經(jīng)典PCR技術(shù)方法條件進(jìn)行優(yōu)化，采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA[11-12]，提取過程無需使用離心機(jī)，采用SYBR Green I熒光檢視[13]代替瓊脂糖凝膠電泳，無需使用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等儀器，將烏梢蛇PCR鑒別方法試驗時間縮短為30min，并研制為快檢試劑盒，為實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用奠定了基礎(chǔ)[14]。

《中國人民共和國藥品管理法》第一百條中規(guī)定：“對有證據(jù)證明可能危害人體健康的藥品及其有關(guān)材料，藥品監(jiān)督管理部門可以查封、扣押，并在七日內(nèi)作出行政處理決定”，藥品質(zhì)量快速篩查方法及產(chǎn)品就是為了在監(jiān)督現(xiàn)場對樣品進(jìn)行快速分析，為藥品監(jiān)管部分及時提供“證據(jù)”，使對大眾身體或財產(chǎn)具有較大危害性的藥品得到提前控制。因此，為更好地開展現(xiàn)場快檢快篩，提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率，有必要對快檢產(chǎn)品進(jìn)行評價，為藥品監(jiān)管部門的選擇和使用提供依據(jù)。筆者通過分析烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢測限等性能指標(biāo)，以及通過與“藥典法”對比，通過對136批市售樣品的檢測，考察試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率、假陽性率和假陰性率，進(jìn)而對烏梢蛇PCR快檢試劑盒進(jìn)行綜合評價，為同類快檢產(chǎn)品的評價提供案例。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 MM400珠式組織細(xì)胞破碎儀(RETSCH)；BIORAD T100 PCR儀(BIORAD)；eppendorf centrifuge5481 離心機(jī)(EPPENDORF)；CAMAG REPROSTAR3薄層色譜照相裝置(CAMAG)；Sub Cell GT水平電泳系統(tǒng) (BIORAD)；Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System 全自動凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)。

1.2 試藥 烏梢蛇PCR快檢試劑盒(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)； Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司)；蛋白酶K(Promega 公司)；Takara Ex Taq(Takara公司)；DNA 分子標(biāo)記(100-1000bp，Takara公司)；中國藥典2015年版烏梢蛇藥典法引物(Invitrogen公司合成)； Agarose G-10瓊脂糖(Biowest)；電泳緩沖液配制試劑EDTA、Tris為分子生物學(xué)級試劑，冰醋酸為分析純。

樣品分為2類，一類是對試劑盒的性能進(jìn)行考察的樣品，樣品信息見表1，樣品均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷教授鑒定；另一類是對試劑盒的應(yīng)用進(jìn)行評價的樣品，收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等，包括市售烏梢蛇粉12批(編號為WS-F001～WS-F012)；市售烏梢蛇飲片29批(編號為WS-S001～WS-S029)；市售酒烏梢蛇42批(WS-J001～WS-J042)；烏梢蛇藥材樣品3批(蛇鲞，編號為WSZ001～WSZ003)；烏梢蛇偽品50批(編號為SL001～SL050)，包括烏梢蛇常見偽品灰鼠蛇、滑鼠蛇、赤鏈蛇等。

表1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能參數(shù)考察用樣品信息表

2 方法

2.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測 參考2015年版中國藥典三部生物診斷試劑盒的要求，對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性等性能進(jìn)行考察。

2.1.1 特異性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各2批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各2批，分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

2.1.2 檢測限 取WS1，分別取25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、4 mg、3 mg、2 mg、1 mg，分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

2.1.3 重復(fù)性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各1批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各1批，在同一實驗室相同條件下，由3位實驗員采用同批次試劑盒分別進(jìn)行試驗，考察批內(nèi)重復(fù)性。同時由同一位實驗員分別采用3個不同批次試劑盒進(jìn)行檢測，考察批間重復(fù)性。

2.1.4 穩(wěn)定性 隨機(jī)選取一個試劑盒，分別放置至溶解，再分別按保存條件保存，如此反復(fù)分別經(jīng)過 1、5、10次后，對試劑盒內(nèi)的DNA提取試劑，陰性對照、陽性對照進(jìn)行檢測。

2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價 實驗人員分為2組，第一組采用中國藥典2015年版一部烏梢蛇項下收載的PCR法對136批樣品進(jìn)行測定賦值，測定好后進(jìn)行隨機(jī)編號，形成盲樣；由第二組采用PCR快檢試劑盒方法進(jìn)行測定，獨立匯總檢測結(jié)果。通過比較兩個實驗室的相應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果不一致的進(jìn)行復(fù)測，計算烏梢蛇PCR快檢試劑盒的陽性結(jié)果準(zhǔn)確率、陰性結(jié)果準(zhǔn)確率、假陰性率、假陽性率等指標(biāo)。

2.2.1 烏梢蛇聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)藥典方法 取樣品0.5 g，充分研磨使成粉末，取0.1 g，照中國藥典2015年版一部烏梢蛇飲片【鑒別】項下操作，簡稱為“藥典法”。

2.2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法分為A、B兩部分，A部分為提取總DNA所用的試劑及耗材，于2～8 ℃保存；B部分為PCR擴(kuò)增部分所用的試劑及耗材，于-20 ℃下保存，簡稱“快檢試劑盒法”。具體操作如下：①取10～25 mg樣品粉末，使用堿裂解法提取總DNA，所提取DNA稀釋10倍作為供試品溶液。另分別取陽性對照品、陰性對照品各10～25mg，同法制成陽性對照品溶液和陰性對照品溶液。②PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系為25 μL，包含預(yù)混反應(yīng)溶液24 μL，待測樣品或陽性、陰性對照DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性1 min；再進(jìn)行28個循環(huán)反應(yīng)，條件為88 ℃變性10s，62 ℃退火并延伸10 s。以無菌雙蒸水作為空白對照，取1 μL，同法擴(kuò)增得到空白對照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。③檢視方法：在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL溶液熒光染料(SYBR Green I)混勻，于紫外光(365nm)下檢測熒光。若顯示綠色熒光，則為陽性結(jié)果，即為烏梢蛇正品，反之則為陰性結(jié)果，即偽品。

3 結(jié)果

3.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測結(jié)果

3.1.1 特異性 采用快檢試劑盒法，烏梢蛇正品、偽品檢測結(jié)果均與標(biāo)定值一致。如圖1所示。

1.WS1; 2.WS2; 3.WS4; 4.WS5; 5.WS7; 6.WS9; 7.W1; 8.W2; 9.W4; 10.W5; 11.W8; 12.W9圖1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒特異性檢測結(jié)果

3.1.2 檢測限 取WS1，按“2.1.2”進(jìn)行試驗，結(jié)果本試劑盒方法檢出限為4 mg。

3.1.3 重復(fù)性 經(jīng)檢測，不同生產(chǎn)批號的快檢試劑盒測定的結(jié)果一致，不同操作人員的檢測結(jié)果亦一致，表明該試劑盒重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性 經(jīng)檢測，反復(fù)凍融1、5、10次后，經(jīng)試劑盒提取的供試品DNA測定結(jié)果一致，表明該試劑盒穩(wěn)定性良好。

3.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價結(jié)果 分別采用“藥典法”和“快檢試劑盒法”對市售烏梢蛇樣品86批(包括烏梢蛇粉12批、烏梢蛇飲片29批、酒烏梢蛇樣品42批，藥材樣品3批)以及偽品飲片50批進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。結(jié)果不一致的批次經(jīng)復(fù)試，復(fù)試結(jié)果與初試結(jié)果一致。

表2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒與藥典法結(jié)果匯總

以“藥典法”檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，測定陽性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為76批，陰性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為60批，“快檢試劑盒法”測得陽性結(jié)果為74批，陰性結(jié)果為62批，陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%，其中酒烏梢蛇樣品中有5個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陰性”，假陰性率為6.6%；陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%，其中烏梢蛇偽品樣品中有3個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陽性”，假陽性率為5.0%。

4 討論

4.1 試驗樣品的代表性 本研究用于考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價的樣品收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等16家，樣品規(guī)格有烏梢蛇粉、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇、烏梢蛇藥材等不同狀態(tài)的樣品，覆蓋了流通領(lǐng)域中各種使用規(guī)格，其中正品76批，偽品60批，總批次數(shù)136批，具有較好的代表性。其中烏梢蛇市售樣品不合格率分別為11.6%，表明市售烏梢蛇質(zhì)量情況不容樂觀，開展現(xiàn)場快篩快檢技術(shù)和產(chǎn)品的應(yīng)用以進(jìn)一步提高監(jiān)督效能十分必要。

4.2 試劑盒的性能評價 經(jīng)對試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及檢測限等性能指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果表明該試劑盒的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，檢測限(最低取樣量)為4 mg。而“藥典法”在增加裂解時間的前提下，檢測限約為10 mg，因此與“藥典法”比較，該試劑盒的檢測限僅為“藥典法”的二分之一。對于烏梢蛇這類價格較為昂貴的品種，檢測限低既可減少檢測成本，同時對于常見的以拼接等制偽手段制成的樣品，可以多部位取樣及增加取樣個數(shù)，進(jìn)一步提高監(jiān)督力度。

4.3 試劑盒的應(yīng)用評價 經(jīng)采用快檢試劑盒對136批樣品進(jìn)行試驗，并與“藥典法”結(jié)果相比較，陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%，陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%，假陽性率為5.0%，假陰性率為6.6%，總體準(zhǔn)確率為94.1%。對假陰性結(jié)果和假陽性結(jié)果進(jìn)行分析，可能與檢視方法有關(guān)，由于烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料(SYBR Green I)，混勻后在紫外光燈(365 nm)下檢視，熒光較弱的情況下可能會影響主觀判斷，造成假陰性或假陽性的結(jié)果。在這種情況下，可采用“藥典法”進(jìn)行進(jìn)一步確證。與“藥典法”相比，該試劑盒取樣量少，簡便快速，使用成本低，作為快速檢測產(chǎn)品，烏梢蛇PCR快檢試劑盒可在監(jiān)督現(xiàn)場進(jìn)行大批量快檢初篩，為打擊烏梢蛇摻假、售假提供的有效的方法和工具，亦為監(jiān)督執(zhí)法贏得了時間。

綜上，研究以中國藥典2015年版一部烏梢蛇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下收載的PCR鑒別方法作為對照，對烏梢蛇PCR快檢試劑盒的性能與應(yīng)用進(jìn)行評價。烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA，基于快速PCR技術(shù)，以SYBR Green I熒光檢視代替瓊脂糖凝膠電泳，將檢測時間縮短至30min以內(nèi)。與藥典收載的PCR法相比，具有操作簡便、耗時短、檢測限低、經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)勢。通過對136批烏梢蛇樣品及常見混偽品進(jìn)行試驗，結(jié)果表明該試劑盒可用于監(jiān)督現(xiàn)場快速篩查，以提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率。本文亦為同類產(chǎn)品的應(yīng)用與評價提供了研究經(jīng)驗。