陳麗

【摘 要】 利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)建立穩(wěn)定表達(dá)FUS（fused in sarcoma）的細(xì)胞系。方法：擴(kuò)增FUS 5'arm序列，puro-T2A-GFP報(bào)告基因，F(xiàn)US 3'arm序列，將3個(gè)片段一次連接至目的載體上。制作長(zhǎng)鏈ssDNA做為同源重組模板。將FUS agRNA，cas9，ssDNA共轉(zhuǎn)染hela和hct116細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞同源重組修復(fù)途徑，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因GFP的敲入，嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞，流式分選純化和富集帶有綠色熒光的細(xì)胞，建立表達(dá)FUS-GFP融合蛋白的細(xì)胞系。結(jié)果：成功構(gòu)建了帶有FUS 5'arm + puro-T2A-GFP+ FUS 3'arm的靶向載體質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠顯示ssDNA的成功產(chǎn)生。共聚焦顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染后藥篩48小時(shí)的hela和hct116細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光。流式分選顯示，帶有綠色熒光的細(xì)胞比例約為30%-40%。結(jié)論：利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了FUS-GFP熒光報(bào)告細(xì)胞系。

【關(guān)鍵詞】 CRISPR/Cas9；knock in；同源重組；ssDNA；FUS

【中圖分類(lèi)號(hào)】R365 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）24-001-01

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)（CRISPR-Cas9）是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復(fù)合體，識(shí)別特定的 DNA序列切割造成雙鏈DNA斷裂，當(dāng)存在同源模板的條件下，發(fā)生同源重組修復(fù)[1]，造成基因敲入（knock in）。這通常通過(guò)在插入DNA的任一側(cè)構(gòu)建具有0.5-1kb的兩個(gè)同源臂的靶向載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前，單鏈寡脫氧核苷酸（ssDNA）已被用作供體模板與工程化核酸酶的組合，并且比雙鏈供體質(zhì)粒更有效[2]。

FUS，全稱(chēng)為fused in sarcoma，是一種RNA結(jié)合蛋白，F(xiàn)US在細(xì)胞核中富集，但在額顳葉癡呆（FTD）或肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）患者的死后腦和脊髓中，存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)聚集體中[3]。已有報(bào)道，F(xiàn)US發(fā)生相分離形成液態(tài)冷凝物，硬化成固態(tài)，這可能是神經(jīng)退行性疾病中不容聚集體形成的原因。此外，F(xiàn)US的入核轉(zhuǎn)運(yùn)可以溶解液態(tài)相分離結(jié)構(gòu)，防止固態(tài)凝聚體造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性[4]。另外，F(xiàn)US在DNA損傷中的功能涉及與組蛋白脫乙酰酶1的直接相互作用[5]。本研究擬構(gòu)建FUS-GFP熒光報(bào)告細(xì)胞系，通過(guò)活細(xì)胞工作站，在X射線照射造成細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的條件下，通過(guò)熒光觀察FUS液滴融合或分離現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 方法

1.2.1 引物序列的設(shè)計(jì)

1.2.2 PCR法擴(kuò)增目的基因序列 FUS 5'arm和FUS 3'arm以基因組為模板，puro-T2A-GFP以質(zhì)粒為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用PrimeSTAR高保真酶（Takara R010B），方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。PCR產(chǎn)物回收后，測(cè)濃度待用。

1.2.3 構(gòu)建靶向載體 目的載體pcDNA3.1雙酶切后，經(jīng)電泳割取目的條帶，回收測(cè)濃度。將線性化載體和上述3條PCR片段按比例混合，使用諾維贊多片段連接試劑盒（諾唯贊 C113-01），實(shí)現(xiàn)多個(gè)線性化DNA的重組。重組產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑克隆鑒定后提質(zhì)粒送測(cè)序。正確的靶向載體命名為pcDNA3.1-FUS-GFP。

1.2.4 Guide-it Long ssDNA system產(chǎn)生ssDNA 用適當(dāng)?shù)牧姿峄镆园邢蜉d體pcDNA3.1-FUS-GFP為模板PCR產(chǎn)生dsDNA。

使用Guide-it Long ssDNA system（Clontech 632644）產(chǎn)生ssDNA，方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 FUS sgRNA的構(gòu)建

將上述寡聚核苷酸單鏈變性、退火后形成雙鏈。雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒相連獲得pGL3-U6-FUS sgRNA質(zhì)粒。

1.2.6 轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞系和hct116細(xì)胞系 轉(zhuǎn)染步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)（Invitrogen STEM00003）。轉(zhuǎn)染后24h加藥。之后每天換液加嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.7 陽(yáng)性細(xì)胞的分選 加藥條件下將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至10cm盤(pán)。消化細(xì)胞，PBS重懸，過(guò)細(xì)胞篩收集于流式管上機(jī)。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)生ssDNA 靶向載體按方法1.1.4產(chǎn)生ssDNA。將雙鏈及單鏈DNA在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖1。

3.2 熒光 轉(zhuǎn)染后藥篩48小時(shí)，可見(jiàn)hela和hct116細(xì)胞中均有綠色熒光，如圖2。說(shuō)明sgRNA和cas9在FUS的起始密碼子附近造成DNA雙鏈斷裂，含有GFP以及兩端各750bp同源臂的ssDNA侵入到DNA斷裂處，通過(guò)細(xì)胞的同源重組修復(fù)途徑，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因GFP的敲入。

3.3 流式分選 流式分選純化和富集帶有綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞，如圖3?？梢?jiàn)，hela細(xì)胞和hct116細(xì)胞中帶有綠色熒光的細(xì)胞比例大約分別為33%和40%。

4 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)由于能快速，高效，簡(jiǎn)便地靶向基因組任何基因，在2012年開(kāi)始像爆炸一般流行起來(lái)。近年來(lái)，相分離又成為生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，相分離與疾病的關(guān)系的研究主要集中在神經(jīng)退行性疾病。FUS可以發(fā)生相分離，其在細(xì)胞質(zhì)中聚集是患有額顳葉癡呆或肌萎縮側(cè)索硬化的患者中的病理性標(biāo)記。并且，DNA修復(fù)的缺陷與神經(jīng)退行性疾病有廣泛的聯(lián)系，但確切的機(jī)制知之甚少。本研究構(gòu)建FUS-GFP熒光報(bào)告細(xì)胞系，可以通過(guò)活細(xì)胞工作站，在X射線照射造成細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的條件下，通過(guò)熒光觀察FUS液滴融合或分離現(xiàn)象，從而方便研究FUS蛋白在DNA損傷修復(fù)等調(diào)節(jié)下的動(dòng)態(tài)變化。

參考文獻(xiàn)

[1] Maria Jasin and Rodney Rothstein. “Repair of strand breaks by homologous recombination.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 5.11 （2013）： a012740.

[2] Peng， Y. et al. Making designer mutants in model organisms. Development 141，4042–4054 （2014）.

[3] Mackenzie， I.R.， Rademakers， R.， and Neumann， M. （2010）. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Lancet Neurol.9， 995–1007.

[4] Guo，L.，et al.（2018）. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transtions of RNA-binding protein with prion-like domains.Cell，173（3），677-692.

[5] Wang WY.，et al.（2013）.Interaction of FUS and HDAC1 regulates DNA damage response and repair in neurons. Nature Neuroscience，16（10）：1383-91.