郭金剛 類承斌

【摘要】 目的：探討U0126對急性白血病細胞HL-60增殖與凋亡的影響。方法：用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞24、48、72 h，MTT法檢測細胞活力，Hoechst染色檢測細胞形態(tài)，EdU染色檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期，Western blot檢測細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）、生存素（Survivin）、p21和p27表達及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化水平。

結(jié)果：5、10、20 μmol/L的U0126處理HL-60細胞24、48、72 h，能顯著提高細胞增殖抑制率（P<0.01），具有時間與劑量依賴性（r=0.421、0.478）。與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能使細胞核發(fā)白，致密濃染，細胞增殖率降低（P<0.01），細胞周期阻滯在G1期（P<0.01），PCNA、Survivin及p-ERK1/2表達均下調(diào)（P<0.01），p21與p27表達均上調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：U0126能顯著抑制白血病細胞HL-60增殖，誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】 U0126； 急性白血??； HL-60； 增殖； 凋亡

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種源自造血干細胞惡性克隆的血液腫瘤，是急性白血病中的一種，約占80%。近年來隨著化療、放療、干細胞技術的不斷進步，AML的治愈率大大提高，但患者的5年生存率仍不到50%[1-2]。因此進一步探討AML的發(fā)病機制、尋找新的治療方法具有重要意義。AML的發(fā)生發(fā)展與眾多信號通路密切相關，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kanase，MAPKs）信號通路就是其中一種，此信號通過三級酶促反應將上游信號傳遞到細胞核，引起一連串生物反應[3-4]。1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-雙[2-氨基苯基硫代]丁二烯（U0126）是該信號通路特異、高效的抑制劑，能夠通過抑制MEK活性，阻斷ERK的磷酸化及信號傳遞[3-4]。有研究顯示，MAPK信號通路成員在白血病中被高度激活，而U0126能顯著抑制黑色素瘤細胞、肺癌細胞、舌鱗癌細胞、膠質(zhì)瘤細胞的增殖[5-7]，但U0126在急性白血病中的作用機制尚未見報道。因此本研究將探討U0126對急性白血病HL-60細胞增殖與凋亡的影響及相關機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 兔抗人PCNA、Survivin、p21、p27、GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體均購自美國Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；U0126、Hoechst染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南通碧云天生物技術有限公司，細胞周期檢測試劑盒南京凱基生物技術有限公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司。DMI4000B倒置熒光顯微鏡購自德國萊卡公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀、DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標儀購自美國thermo公司。

1.2 細胞株 人早幼粒白血病細胞HL-60購于中國科學院細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在細胞密度達到80%時候以1︰3的比例傳代，選取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)的實驗研究。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測HL-60細胞活力 將5×103個HL-60細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞24、48、72 h，加入20 μL的MTT孵育4 h，將96孔板中翻轉(zhuǎn)過來棄去上清液，再每孔加入150 μL的二甲基亞砜，于微量振蕩器震蕩使結(jié)晶物溶解，在酶標儀波長560 nm處測OD值，細胞增殖抑制率（%）=（U0126組OD值-空白組OD值）/（control組OD值-空白組OD值×100%。

1.3.2 Hoechst染色檢測HL-60細胞形態(tài) 將8×103個HL-60細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞48 h，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，加入終濃度為10 μg/mL的Hoechst染色液，染色5 min，PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡的細胞熒光更強，細胞核發(fā)白，呈現(xiàn)皺染。

1.3.3 EdU染色檢測HL-60細胞增殖情況 將5×103個HL-60細胞接種到96孔板，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞48 h，每孔加入終濃度為50 μM的EdU染液并孵育2 h，PBS洗滌3次；接著加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，接著加入50 μL濃度為2 mg/mL的甘氨酸搖床孵育5 min，同時也可以加入100 μL的0.5%的TritonX-100進行滲透加強，PBS洗滌3次。緊接著每孔加入100 μL的1×Apollo染色液于室溫避光反應30 min，PBS洗滌3次。每孔繼續(xù)加入100 μL的Hoechst33342染色液，于室溫避光反應30 min，PBS洗滌3次。最后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU染色呈現(xiàn)紅光，Hoechst染色呈現(xiàn)藍光。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞周期 將8×103個HL-60細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞48 h，每組細胞首先收集1×105/mL個細胞，再加入5 μL的Rnase，吹打混勻后，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.3.5 Western blot檢測細胞中PCNA、Survivin、p21、p27及p-ERK1/2蛋白的表達 將8×103個HL-60細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細胞48 h，在冰浴條件下將6孔板中細胞刮下來，離心收集細胞，并加入細胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸10 min進行變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液（兔抗人PCNA，Survivin，p21，p27，GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1︰100；兔抗人ERK1/2，p-ERK1/2多克隆抗，稀釋度為1︰200）孵育，4 ℃過夜；二抗溶液室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件統(tǒng)計各抗體條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 U0126對HL-60細胞活力的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細胞24、48、72 h后，經(jīng)MTT實驗發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間延長，細胞增殖抑制率顯著提高（r=0.421，P<0.01），同時隨著U0126濃度升高，細胞增殖抑制率顯著提高（r=0.478，P<0.01）。且在48 h細胞活力適于后續(xù)實驗研究，因此選擇48 h作為后續(xù)實驗時間。見表1。

2.2 U0126對HL-60細胞凋亡、細胞增殖及細胞周期的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細胞48 h，經(jīng)Hoechst染色實驗發(fā)現(xiàn)，5、10、20 μmol/L的U0126能使細胞核發(fā)白，皺染，說明細胞凋亡顯著，見圖1。0、5、10、20 μmol/L

的U0126作用HL-60細胞48 h，經(jīng)EdU染色實驗發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能逐漸降低細胞增殖率（P<0.01），見圖2和表2。0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細胞48 h，經(jīng)流式細胞術實驗發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能逐漸使細胞周期阻滯在G1期（P<0.01），見表2。

2.3 U0126對HL-60細胞中細胞周期及細胞凋亡相關蛋白表達的影響 0、5，10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細胞48 h，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能顯著下調(diào)PCNA與Survivin表達，上調(diào)p21與p27表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖3和表3。

2.4 U0126對HL-60細胞中ERK1/2磷酸化水平的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細胞48 h，與0 μmol/L的（1.38±0.14）比較，5、10、20 μmol/L的U0126[（1.09±0.11），（0.72±0.70），（0.43±0.04）]均能顯著下調(diào)p-ERK1/2表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖4。

3 討論

MAPK信號通路是真核生物中一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路，參與了細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期等多種生理病理過程。MAPK通過三級酶促反應（MAPKKK-MAPKK-MAPK）將上游信號傳遞到細胞核中使得細胞產(chǎn)生相應的應答。Extracellular signal-regulated kanse（ERK）是MAPK信號通路關鍵成員之一，包括兩個亞基ERK1和ERK2，外界刺激通過Ras-Raf-MEK通路將信號傳遞給ERK，ERK被磷酸化，進入細胞核，調(diào)控相關基因表達，影響細胞分裂、生長、增殖、凋亡、細胞周期等行為[3-4]。研究已經(jīng)表明，ERK信號通路在白血病中高度激活，并與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。U0126是MAPK信號通路特異的、高效的、可逆的抑制劑，是ATP非競爭性的MEK抑制劑，不僅能夠抑制活化的MEK1/2還能抑制未活化的MEK1/2，當U0126進入細胞內(nèi)，能夠特異性地結(jié)合于MEK上，改變MEK結(jié)構，進而遏制MEK活性，阻斷MEK/ERK信號通路的傳遞[3-4]。研究已經(jīng)表明U0126作為MAPK信號通路特異性抑制劑，能顯著地抑制黑色素瘤細胞、肺癌細胞、舌鱗癌細胞、膠質(zhì)瘤細胞增殖[5-7]，但U0126在急性白血病細胞中的作用機制尚未見報道，因此本課題組將對此展開研究。本研究首先利用不同濃度（5、10、20 μmol/L）的U0126作用急性白血病HL-60細胞24、48、72 h，MTT結(jié)果表明U0216能顯著提高HL-60細胞增殖抑制率，具有時間及劑量依賴性。接著利用Hoechst染色和EdU染色進一步檢測U0126對HL-60細胞形態(tài)及細胞增殖的影響，結(jié)果表明U0126能使HL-60細胞核發(fā)白、皺染，能顯著降低細胞增殖率，進一步說明U0126對HL-60細胞增殖及凋亡具有顯著的抑制或誘導作用，與U0126在其他腫瘤細胞中的效果一致[5-7]。

細胞周期的不可控制是腫瘤細胞無限增殖、凋亡受限制的重要原因，細胞周期主要調(diào)控點G1、S期，G2期也是眾多抗腫瘤藥物的主要作用靶點，特別是G1期，是決定著細胞是否能夠進入S期，是否能夠正常進行DNA復制、有絲分裂的前提[9-10]。所以本研究繼續(xù)探討U0126對HL-60細胞周期的影響，流式結(jié)果表明U0126能使細胞周期阻滯在G1期，能使細胞阻滯于DNA復制前期。細胞的增殖、凋亡受細胞凋亡相關蛋白、細胞周期蛋白調(diào)控。PCNA是一種發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡與細胞周期密切相關的蛋白，在G1期晚期表達量大大提升，在S期達到頂峰，同時能與細胞周期蛋白（CyclinD1），細胞周期依賴性激酶（CDKs）及p21形成四聚體參與細胞周期的調(diào)控[11]。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)分子量最小的凋亡抑制因子，定位于17q25，主要表達于細胞周期的G2期。Survivin除了在胚胎組織外，在正常組織中幾乎不表達，而在多種腫瘤組織中高表達，并與疾病的發(fā)展及預后密切相關，被認為是判斷腫瘤發(fā)生和預后的有效標志物[12]。p21和p27是細胞周期依賴性激酶抑制劑的主要成員之一，p21能抑制CyclinD1與CDK4/CDK6的結(jié)合，阻滯細胞周期于G1期。p27能抑制CyclinD1/CDK2復合物的形成，從而也使細胞周期阻滯在G1期[13]。同時有研究表明腫瘤組織中ERK信號通路的激活與PCNA、Survivin、p21及p27的高表達或低表達密切相關，提示U0126可能可以通過調(diào)控上述蛋白表達影響HL-60細胞增殖與凋亡[14-15]。所以本研究利用Western blot檢測U0126對HL-60細胞中PCNA、Survivin、p21及p27表達的影響，結(jié)果表明U0126能顯著下調(diào)PCNA與Survivin表達，上調(diào)p21與p27，此結(jié)果正好與U0126使細胞周期阻滯于G1期一致。另外本研究繼續(xù)利用Western blot檢測U0126對HL-60細胞中ERK磷酸化水平的影響，結(jié)果表明U0126能顯著的降低ERK1/2磷酸化水平。

綜上所述，5、10、20 μmol/L的U0126能顯著提高HL-60細胞增殖抑制率，具有時間及劑量依賴，同時U0126能使HL-60細胞核發(fā)白、皺染，降低細胞增殖率，使細胞周期阻滯于G1期，能顯著下調(diào)PCNA與Survivin的表達，上調(diào)p21與p27，此過程與降低ERK1/2磷酸化水平有關。

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（收稿日期：2018-06-25） （本文編輯：程旭然）