李曉曦 陳宇恒 唐秀鳳 高瑩瑩 于萍 馬紫童 劉仁慧

[摘要] 目的 研究淫羊藿、女貞子單用及配伍對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠內(nèi)分泌臟器及骨量的影響。 方法 將SPF級雌性SD大鼠48只按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、淫羊藿組、女貞子組、淫羊藿女貞子配伍組（配伍組）、雷洛昔芬組（陽性藥組）。除假手術(shù)組外，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后1周開始給予相應(yīng)的藥物治療至術(shù)后13周結(jié)束。取右側(cè)股骨進(jìn)行骨量測定，取子宮、腎上腺、垂體行HE染色及病理計(jì)量分析。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組骨量及子宮指數(shù)、腎上腺指數(shù)、垂體指數(shù)均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），子宮內(nèi)膜及宮壁厚度、內(nèi)膜/宮壁比值，腎上腺束狀帶、球狀帶及皮質(zhì)厚度，垂體嗜堿性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，淫羊藿組、女貞子組及配伍組能顯著增加骨量，子宮內(nèi)膜及宮壁厚度、內(nèi)膜/宮壁比值，腎上腺束狀帶、球狀帶及皮質(zhì)厚度，垂體嗜堿性細(xì)胞計(jì)數(shù)（P < 0.05或P < 0.01）;配伍組可顯著增加腎上腺指數(shù)（P < 0.05）;配伍組與淫羊藿組能顯著增加垂體指數(shù)（P < 0.01）。 結(jié)論 淫羊藿、女貞子單用及配伍防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠骨質(zhì)疏松的作用可能與改善內(nèi)分泌器官的功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;淫羊藿;女貞子;子宮;垂體;腎上腺

[中圖分類號] R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（b）-0012-05

Abstract] Objective To research the effects of Epimedii Folium， Ligustri Lucidi Fructus and synergy of the two herbs on bone mass and endocrine organs in postmenopausal osteoporosis rats. Methods Forty-eight female SD rats of SPF level were divided into sham group， model group， Epimedii Folium group， Ligustri Lucidi Fructus group， synergy of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus group （synergy group） and Raloxifene group （positive drug group） by random number table method. Except for sham group， the other groups were taken bilateral oophorectomy， and all rats were administrated with the corresponding medicines from postoperative 1 week to postoperative 12 weeks. The bone mass of right femurs was detected， and the uterus， adrenal gland and pituitary were collected to take hematoxylin-eosin staining and pathometriometric analysis. Results Compared with sham group， the bone mass， the uterus index， adrenal index and pituitary index in the model group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， the endometrial thickness， uterine wall thickness， and the ratio of endometrial thickness to uterine wall thickness， the thickness of adrenal zona fasciculate， zona glomerulosa and cortex， and the number of basophil cells of pituitary in the model group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the model group， Epimedii Folium group， Ligustri Lucidi Fructus group and synergy group could significantly increase the bone mass， endometrial thickness， uterine wall thickness， and the ratio of endometrial thickness to uterine wall thickness， the thickness of adrenal zona fasciculate， zona glomerulosa and cortex and the number of basophil cells of pituitary （P < 0.05 or P < 0.01）; synergy group could ignificantly increase adrenal index （P < 0.05）; synergy group and Epimedii Folium group could significantly increase pituitary index （P < 0.01）. Conclusion The effects of Epimedii Folium， Ligustri Lucidi Fructus and synergy of the two herbs in prevention and treatment of osteoporosis in rats with postmenopausal osteoporosis may be related to the improvement of the function of the endocrine organs.

[Key words] Postmenopausal osteoporosis; Epimedii Folium; Ligustri Lucidi Fructus; Uterus; Pituitary; Adrenal gland

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是絕經(jīng)后婦女的常見病及多發(fā)病，主要因卵巢功能減退、雌激素水平下降，導(dǎo)致骨生成和骨吸收的代謝失衡。據(jù)有關(guān)資料顯示，全國骨質(zhì)疏松癥患者已近7000萬人，PMOP約占80%，而且隨著人口不斷的老齡化，其患病率還將進(jìn)一步上升[1]。大量研究表明，中醫(yī)藥防治PMOP具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其中淫羊藿、女貞子是臨床常用的治療PMOP的補(bǔ)腎中藥。課題組前期研究提示，以“陰陽雙補(bǔ)，益精壯骨”立法的淫羊藿、女貞子配伍對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的低轉(zhuǎn)化性骨質(zhì)疏松癥及維甲酸誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)化性骨質(zhì)疏松癥均有較好的防治作用[2-4]，并且能提高性激素水平[5]。前期研究結(jié)果為淫羊藿女貞子配伍改善PMOP的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究采用雙側(cè)去卵巢手術(shù)誘導(dǎo)大鼠PMOP模型，通過觀察淫羊藿、女貞子配伍及單用對骨量及內(nèi)分泌器官包括子宮、腎上腺及垂體的病理組織學(xué)的影響，探討藥物防治PMOP的作用與改善內(nèi)分泌功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康雌性SD大鼠，8月齡，體重（390±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001，動物倫理號：AEEI-2016-178。SPF級動物環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

1.2 儀器與藥物

中藥材淫羊藿、女貞子購自北京同仁堂藥店;鹽酸雷洛昔芬片購自LILLY，SA（西班牙，C614454）;注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司（F6082102）。尼康（Nikon）ECLIPSE 80i生物顯微鏡及NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件購自北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司。

1.3 中藥材煎煮方法

分別稱取適量淫羊藿飲片、女貞子飲片及淫羊藿女貞子飲片（4∶3），首煎加8倍體積的水浸泡1 h后加熱煮沸，文火保持沸騰30 min，攪拌、趁熱濾取藥液;藥渣再加原藥量6倍的水加熱煮沸，改文火續(xù)煎30 min后過濾，合并2次藥液，濃縮至含生藥0.35 g/mL，4℃保存。

1.4 造模方法

參考文獻(xiàn)[6]，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)造模（術(shù)前8 h禁食）。在無菌條件下各組大鼠均用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，取腹腔正中切口。除假手術(shù)組外，各組大鼠均行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，然后縫合腹部;假手術(shù)組用同樣手術(shù)方法暴露卵巢，切除少量脂肪，不摘除卵巢。術(shù)后每只大鼠給予青霉素鈉鹽20萬U/d肌注，連續(xù)3 d。以子宮萎縮及骨量明顯降低為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥

按照隨機(jī)數(shù)字表法將動物分成六組，每組8只，包括假手術(shù)組、模型組、淫羊藿組、女貞子組、淫羊藿女貞子配伍組（配伍組）、雷洛昔芬組（陽性藥組）。術(shù)后1周開始灌胃給藥，淫羊藿組、女貞子組及配伍組的給藥量均為7.0 g/kg體重，陽性藥組的用藥量為6.25 mg/kg體重。每日1次，共計(jì)給藥12周。

1.6 觀察指標(biāo)

大鼠腹腔麻醉處死。取右側(cè)股骨稱濕重、測量體積后，將股骨置烤箱內(nèi)110℃加熱24 h，稱干重;后放入600℃馬弗爐內(nèi)加熱3 h，冷卻后稱灰重。摘取腎上腺、子宮、垂體稱重，右側(cè)腎上腺、子宮、垂體固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi)，后行HE染色，子宮切片100倍光鏡下行病理計(jì)量學(xué)分析，腎上腺及垂體切片在400倍光鏡下行病理計(jì)量學(xué)分析。子宮的病理參數(shù)為宮壁厚度、內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜/宮壁[7];腎上腺的病理參數(shù)包括球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶及皮質(zhì)總厚度[8];垂體的病理參數(shù)是垂體內(nèi)嗜堿性細(xì)胞數(shù)[9]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane′s T2（方差不齊）檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿、女貞子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠骨量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組相對骨量，包括濕重/體積、干重/體積、灰重/體積均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，4個(gè)給藥組均能明顯升高濕重/體積與灰重/體積（P < 0.05或P < 0.01）;淫羊藿組、女貞子組及配伍組均能顯著升高干重/體積（P < 0.05）。見表1。

2.2 淫羊藿、女貞子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠子宮的影響

與假手術(shù)組比較，模型組子宮指數(shù)顯著降低（P < 0.01），子宮HE染色的病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，模型組子宮內(nèi)膜及整個(gè)宮壁的厚度、內(nèi)膜與宮壁厚度的比值均較假手術(shù)組顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與模型組比較，各給藥組對子宮指數(shù)無顯著影響（均P > 0.05），但能顯著增加內(nèi)膜、宮壁厚度及內(nèi)膜與宮壁厚度的比值（P < 0.05或P < 0.01）。此外，配伍組較淫羊藿組能顯著增加子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜與宮壁厚度的比值（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 淫羊藿、女貞子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠腎上腺的影響

與假手術(shù)組比較，模型組腎上腺指數(shù)顯著降低（P < 0.01）;腎上腺病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，模型組腎上腺皮質(zhì)總厚度、束狀帶及網(wǎng)狀帶厚度較假手術(shù)組明顯降低（P < 0.05）。與模型組比較，配伍組腎上腺指數(shù)顯著增高（P < 0.05）;淫羊藿組、女貞子組及配伍組均能顯著增加腎上腺皮質(zhì)總厚度、束狀帶及網(wǎng)狀帶厚度（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.4 淫羊藿、女貞子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠垂體的影響

與假手術(shù)組比較，模型組垂體重量及指數(shù)均顯著降低（P < 0.01）;垂體HE染色后嗜堿性細(xì)胞數(shù)亦顯著下降（P < 0.01）。與模型組比較，淫羊藿組、配伍組及陽性藥組垂體重量及指數(shù)均顯著上升（P < 0.05或P < 0.01）;4個(gè)給藥組嗜堿性細(xì)胞數(shù)顯著上升（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

3 討論

PMOP的骨代謝失衡與雌激素水平降低導(dǎo)致的內(nèi)分泌功能紊亂與衰老密切相關(guān)，子宮、垂體、腎上腺功能失調(diào)會影響雌激素的合成及骨代謝水平。文獻(xiàn)報(bào)道，在絕經(jīng)期婦女及去卵巢手術(shù)后的大鼠中，子宮逐漸萎縮[10]。為評價(jià)去卵巢手術(shù)是否成功，本研究觀察了子宮指數(shù)及子宮的病理改變。與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)子宮顯著萎縮現(xiàn)象，表現(xiàn)為子宮指數(shù)減輕，子宮的內(nèi)膜、宮壁厚度及內(nèi)膜/宮壁厚度比值均顯著降低。淫羊藿、女貞子單用及配伍使用均可顯著改善子宮內(nèi)膜、宮壁厚度及內(nèi)膜/宮壁厚度的比值，提示其有一定的預(yù)防子宮萎縮的作用。此外，淫羊藿、女貞子配伍的改善作用優(yōu)于淫羊藿單用，提示配伍組方中補(bǔ)陰藥女貞子對子宮萎縮的改善作用較好及配伍作用的優(yōu)勢。

除卵巢外，腎上腺是合成雌激素的重要內(nèi)分泌器官[10]。Venkatesh等[11]報(bào)道，去卵巢大鼠術(shù)后腎上腺重量顯著降低。為進(jìn)一步評價(jià)雌激素缺乏對內(nèi)分泌器官的影響，本研究計(jì)算了腎上腺指數(shù)并分析了腎上腺HE染色后腎上腺皮質(zhì)各層的厚度，研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎上腺指數(shù)及腎上腺束狀帶、網(wǎng)狀帶及整個(gè)皮質(zhì)厚度均顯著降低，提示腎上腺處于萎縮狀態(tài)且腎上腺的內(nèi)分泌功能減退，性激素合成亦顯著減少。淫羊藿、女貞子單用及配伍使用后，均可以顯著改善腎上腺的病理參數(shù)值，但僅配伍組可以顯著增加腎上腺指數(shù)，提示淫羊藿、女貞子單用及配伍均可改善腎上腺的內(nèi)分泌功能，配伍后還能預(yù)防腎上腺的萎縮。

雌激素是腦垂體細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)因子之一，去卵巢大鼠可導(dǎo)致腦垂體細(xì)胞凋亡[12]。嗜堿性細(xì)胞是垂體中分泌促甲狀腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素和促性腺激素的一類內(nèi)分泌細(xì)胞，主要影響雌激素的合成與骨骼的發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠垂體指數(shù)及垂體中嗜堿性細(xì)胞數(shù)在去卵巢手術(shù)后均顯著降低，提示術(shù)后垂體功能減退。給予淫羊藿、女貞子單用及配伍治療后，垂體中嗜堿性細(xì)胞數(shù)均顯著升高;淫羊藿組及配伍組可以顯著改善垂體指數(shù)，提示淫羊藿、女貞子單用及配伍能改善垂體的內(nèi)分泌功能。此外，淫羊藿單用、淫羊藿女貞子配伍有一定的預(yù)防垂體萎縮的作用。

淫羊藿、女貞子分別為補(bǔ)腎陽、補(bǔ)腎陰藥，是中醫(yī)藥防治更年期綜合征及PMOP的常用藥物[14-15]。二者合用，有平補(bǔ)陰陽、益腎健骨的功效，是首都國醫(yī)名師李世增教授臨床常用于防治骨質(zhì)疏松癥的基本方。現(xiàn)代研究證實(shí)，淫羊藿及女貞子均有雌激素樣作用[16-18]，同時(shí)對骨質(zhì)疏松癥大鼠具有多種保護(hù)作用。淫羊藿及其有效成分可有效糾正骨代謝異常，降低骨轉(zhuǎn)換率，增加骨密度，改善骨組織病理狀態(tài)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松性骨折修復(fù)，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[19-21]。女貞子可顯著抑制過高的骨轉(zhuǎn)換率，提高鈣吸收，減少鈣排放，維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[22-23]。本研究以去卵巢導(dǎo)致的PMOP大鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)淫羊藿（7 g/kg）、女貞子（7 g/kg）、淫羊藿女貞子配伍（淫羊藿4 g/kg合女貞子3 g/kg）對骨量的下降，包括干重/體積、灰重/體積、濕重/體積均有改善作用，且均能增加子宮內(nèi)膜及宮壁厚度，腎上腺束狀帶、網(wǎng)狀帶及皮質(zhì)厚度，垂體嗜堿性細(xì)胞數(shù)，提示對骨量的改善作用可能與調(diào)節(jié)內(nèi)分泌臟器的功能有關(guān)。雖然配伍組中淫羊藿、女貞子的用量較單用少，但對子宮內(nèi)膜厚度的改善作用顯著優(yōu)于淫羊藿單用，且具有女貞子單用所不具有的對垂體指數(shù)的增加作用，提示配伍用均較單用更具優(yōu)勢。

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（收稿日期：2018-04-28 本文編輯：張瑜杰）