陳勇忠 衛(wèi)秀洋 翁少煌 劉永平

[摘要] 目的 觀察硫酸鈣-鏈霉素緩釋顆粒在兔體內(nèi)的緩釋效果及安全性評價。 方法 取大白兔 48 只，隨機分為兩組，每組24只。實驗組在脛骨近端骨缺損置入的硫酸鈣鏈霉素顆粒;對照組植入同樣重量的鏈霉素粉劑。高效液相色譜儀（HPLC）測鏈霉素濃度。于術(shù)后1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周取靜脈血1 mL待檢;在孔周圍取組織待檢。術(shù)后2周、6周行肝腎抽血檢查及肝、腎臟組織病理切片檢查。術(shù)后1周、2周、4周、8周行植入部位X射線檢查。 結(jié)果 實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周最低殺細菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），植入10周尚處于最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織的2周MBC，植入3周處于MIC;鏈霉素在血液的1周MBC，植入2周處于MIC。兩組血液和組織的藥物濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肝臟、腎臟功能生化檢查、病理切片檢查顯示安全性良好，無毒性反應(yīng)，兩組肝臟、腎臟功能組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。X線及病理學(xué)檢查顯示實驗組有著良好的成骨性。 結(jié)論 硫酸鈣-鏈霉素顆粒在兔子體內(nèi)緩慢釋放，達到緩釋效果，對肝腎組織無損傷。

[關(guān)鍵詞] 硫酸鈣;鏈霉素;緩釋顆粒;抗結(jié)核

[中圖分類號] R687.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）36-0034-04

[Abstract] Objective To observe the sustained release effect and safety evaluation of Calcium-streptomycin sulfate sustained-release granules in rabbits. Methods 48 rabbits were randomly divided into two groups， with 24 rabbits in each group. The experimental group was placed with calcium sulfate streptomycin granules in the proximal humerus bone defect.The control group was implanted with the same weight of streptomycin powder. The streptomycin concentration was measured by high performance liquid chromatography（HPLC）. 1 mL of venous blood was taken at 1 day， 2 days， 3 days， 1 week， 2 weeks， 4 weeks， 6 weeks， 8 weeks， 10 weeks after surgery for detection. The tissue was taken around the hole for examination. Liver and kidney blood tests and pathological biopsy of liver and kidney were performed at 2 weeks and 6 weaks after operation. X-ray examination of the implant site was performed at 1 week， 2 weeks， 4 weeks， and 8 weeks after surgery. Results Streptomycin in the experimental group maintained a minimum bactericidal concentration（MBC） for 9 weeks in the surrounding tissues， and was still at minimally inhibitory concentration（MIC） at 10 weeks after implantation. It could maintain a MBC for 8 weeks in venous blood and MIC at 9 weeks after implantation. Streptomycin in the control group maintained a minimum bactericidal concentration（MBC） for 2 weeks in the surrounding tissues， and was still at minimally inhibitory concentration （MIC） at 3 weeks after implantation. It could maintain a MBC for 1 week in venous blood and MIC at 2 weeks after implantation. There were significant differences in the drug concentrations of blood and tissue between the two groups（P<0.05）. Liver and kidney function biochemical examination and pathological biopsy showed good safety and no toxicity. There was no significant difference between the two groups in liver and kidney function between two groups（P>0.05）. X-ray and pathological examination showed that the experimental group had good osteogenicity. Conclusion Calcium-streptomycin sulfate particles are slowly released in rabbits， which can achieve sustained release effect and has no damage to liver and kidney tissues

[Key words] Calcium sulfate; Streptomycin; Sustained release granules; Anti-tuberculosis

鏈霉素作為一線抗結(jié)核藥物之一，但是不能口服給藥，臨床常肌肉注射，連續(xù)肌肉注射長達3個月，患者難以堅持，注射部位感染、硬結(jié)、肌肉攣縮，長期使用可導(dǎo)致腎毒性和耳毒性。若在清除結(jié)核病灶后直接在創(chuàng)面撒上鏈霉素粉劑，有效藥物濃度維持時間不夠長;如果病灶內(nèi)一次給予過量的藥物，雖然可以提高藥物在局部濃度和有效作用時間，但其不良反應(yīng)的發(fā)生率高。局部藥物緩釋系統(tǒng)，是一種理想的給藥方式[1-5]。醫(yī)用硫酸鈣不僅作為藥物載體而且作為填充骨缺損的修復(fù)材料已在臨床上應(yīng)用[6-7]。本研究硫酸鈣-鏈霉素制造成緩釋系統(tǒng)顆粒植入兔子內(nèi)體，觀察周圍肌肉組織、血液藥物濃度、肝臟、腎臟組織病理學(xué)研究，為臨床治療骨結(jié)核提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物選用新西蘭大白兔48只（6月齡，雌雄不拘），體重2.5 kg左右（福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格1 g/瓶，國藥準字H37020187）;醫(yī)用硫酸鈣（英國百賽公司，5cc思迪骨粉）。

1.2 硫酸鈣-鏈霉素緩釋顆粒制作

以1 g鏈霉素注射粉劑與5 cc醫(yī)用硫酸鈣粉劑，全部倒入無菌混料碗中，預(yù)先攪拌混勻后倒入2 mL配套的混合液滅菌注射用水;充分攪拌直至均勻的膏糊狀（大約需30 s）。在提供的3 mm×3 mm圓柱狀的模具中均勻涂抹一層膏糊。確保每個顆?？籽ň惶畛錆M;填充時用20N的壓力（或用2 kg砝碼）加壓驅(qū)趕殘存的空氣;讓膏糊在模具內(nèi)至少停留15 min固化;伸縮模具釋放顆粒。硫酸鈣-鏈霉素顆粒電子顯微鏡下顯示：結(jié)構(gòu)以棒狀結(jié)構(gòu)為主，硫酸鈣寬度為7.5～10.0 μm，長40～50.0 μm，鏈霉素為顆粒形狀為主5 μm×5 μm×5 μm。

1.3 分組及模型制作

48只新西蘭兔，隨機分為兩組，實驗組硫酸鈣-鏈霉素顆粒、對照組鏈霉素，每組各24只。

實驗用兔置于固定架中，使用地西泮（1 mg/kg）經(jīng)耳源靜脈注射麻醉。待兔完全麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺。單側(cè)下肢脛骨上段手術(shù)區(qū)備皮，酒精和碘伏消毒后鋪巾。以脛骨近端內(nèi)側(cè)為中心做縱行切口，長約3 cm。依次切開皮膚、皮下，從肌間隙進入至脛骨內(nèi)側(cè)，剝離骨膜。以脛骨近端處為中心，用電鉆開槽并逐漸擴孔至長10 mm，寬6 mm圓柱形骨缺損，生理鹽水沖洗創(chuàng)口。A組孔內(nèi)置入滅菌的顆粒4顆，含鏈霉素約12 mg，共48 mg。對照組植入同樣份量的鏈霉素?？p合筋膜包裹骨骼創(chuàng)面，縫合皮膚。放回籠內(nèi)飼養(yǎng)并觀察。術(shù)后肌注頭孢唑啉鈉250 mg，連續(xù)3 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 血藥及組織濃度檢測? 于術(shù)后1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周，取對側(cè)耳緣靜脈血1～2 mL待檢;在孔半徑5 mm處對稱取0.5 mg大小組織4塊，分別粉碎后加5 mL PBS勻漿，400 r/min離心15 min，留取上清液-20℃凍存待檢。高效液相色譜法測定鏈霉素濃度。

1.4.2 硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)組織相容性測定? 取術(shù)后2周、6周實驗兔植入部位、肝、腎臟組織，常規(guī)制成病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。取術(shù)后2周、6周實驗兔的耳緣靜脈血、做肝、腎功能檢查。

1.4.3 硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)成骨檢測? 實驗兔術(shù)后1周、2周、4周、8周行植入部位X射線檢查，了解成骨情況;術(shù)后8周實驗兔植入部位取材，制成病理切片，光鏡檢查成骨情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用獨立樣本t檢驗進行兩組間的比較，計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兔麻醉清醒后，覓食水正常。實驗組死亡2只，對照組死亡1只，為保證數(shù)據(jù)的準確性，及時補充動物。死亡原因是患肢骨折后導(dǎo)致傷口感染，死亡。其余動物順利完成本實驗，生長平穩(wěn)，活動尚可，傷口均能達到愈合，未出現(xiàn)排異反應(yīng)等并發(fā)癥。

2.2 血藥濃度及組織濃度，以及藥物代謝曲線

實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周MBC，植入10周尚處于MIC。靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織的2周MBC，植入3周處于MIC;血液的1周MBC，植入2周處于MIC。兩組血液和組織的藥物濃度持續(xù)時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)組織相容性測定

術(shù)后肝腎組織取病理檢查提示，術(shù)后早期2周、術(shù)后晚期6周細胞形態(tài)良好，肝腎無器質(zhì)性改變。

2.4 血肝腎功能檢查

肝功能、腎臟功能檢查顯示2周后動物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN），較正常對照組均無明顯升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。6周后動物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN），較正常對照組均無明顯升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)前與術(shù)后實驗組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）指標均無明顯升高，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)成骨檢測

實驗兔術(shù)后1周、2周、4周、8周行植入部位X射線檢查，顆粒逐漸緩釋，消失。局部出現(xiàn)誘導(dǎo)成骨。術(shù)后8周實驗兔植入部位取材，制成病理切片，可見骨細胞長入，內(nèi)含毛細血管、中性粒細胞。

3 討論

骨結(jié)核好發(fā)于脊柱、股骨遠端、脛骨近端及膝關(guān)節(jié)。如果診治不及時或不規(guī)范，極易造成關(guān)節(jié)毀損或椎體破壞、甚至累及椎管，壓迫脊髓神經(jīng)，造成癱瘓[8-9]。脊柱椎體的上下椎板、股骨遠端、脛骨近端等部位主要由骨細胞軟骨細胞、致密膠原及糖蛋白基質(zhì)共同構(gòu)成，自身修復(fù)困難。同時病灶周圍壞死硬化的骨具有屏障作用，導(dǎo)致局部藥物濃度過低或者不能達到病灶[10-11]。因此在治療脊柱、關(guān)節(jié)骨結(jié)核時，不僅要規(guī)范地抗結(jié)核，維持局部有效血藥濃度，還要解決局部病灶成骨、修復(fù)的問題。

病灶局部搭載含鏈霉素緩釋藥物人工骨支架植入是當(dāng)前理想的解決策略[12-13]。醫(yī)用硫酸鈣是一種良好的骨修復(fù)填充材料，廣泛應(yīng)用于口腔科和矯形外科[14-15]。文獻報道，硫酸鈣具備諸多理想的骨移植替代材料的特點：①能在生物體內(nèi)完全吸收;②較好的生物相容性、可成形性，植入后能與原骨組織形成生理結(jié)合;③為新骨生長提供支架，填補骨缺損，防止周圍軟組織快速長入;降解后提供大量的鈣離子，刺激成骨細胞活性，誘導(dǎo)成骨;④滅菌方便且自然界中蘊含量豐富。近幾年來，曾嘗試將鏈霉素和硫酸鈣做成緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于脊柱結(jié)核的治療，取得了預(yù)期的療效[16-17]。

根據(jù)實驗結(jié)果顯示，硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)顆粒在兔子脛骨實驗藥物代謝曲線顯示，組織內(nèi)的鏈霉素可在體內(nèi)持續(xù)釋放，能夠維持局部有效治療的藥物濃度。鏈霉素可維持高于10倍結(jié)核分枝桿菌MIC，長達10周。文獻報道抗結(jié)核藥物一般最低殺菌濃度MBC為最低抑菌濃度MIC的10倍。鏈霉素的MIC為0.05 μg/mL。該顆粒在動物體內(nèi)2周左右出現(xiàn)崩解，藥物累計釋放量突然增加，藥物濃度達到高峰，而后逐漸降低，表明存在突釋現(xiàn)象。藥物的突釋也是藥物工作者共同存在的問題。資料顯示，藥物突釋的定義3 d內(nèi)釋放量比例不超過總量的40%[18]。本緩釋顆粒3 d時累計釋放量30%，在藥物突釋的范圍內(nèi)。同時電鏡下結(jié)構(gòu)顯示，鏈霉素與硫酸鈣棒狀的分子結(jié)構(gòu)，分子間相互交錯成形，達到后續(xù)的緩慢釋放作用。

文獻表明，當(dāng)血藥濃度達到50 μg/mL以上時不良反應(yīng)增加，肝毒性、腎毒性可能出現(xiàn)。從實驗的血藥濃度數(shù)據(jù)顯示，血藥濃度相對平穩(wěn)，雖然出現(xiàn)峰值，突釋現(xiàn)象存在，但是峰值及維持的血藥濃度均低于50 μg/mL。故該實驗安全性評價良好。同時實驗組在9周內(nèi)均可檢測到高于10倍×結(jié)核分枝桿菌MIC。已經(jīng)達到抗結(jié)核治療的目的。從實驗藥物代謝曲線的數(shù)據(jù)可以得出，局部組織的藥物濃度均高于同期的血液藥物濃度，且能夠長時間地維持結(jié)核分枝桿菌MIC。從藥物濃度代謝曲線也可證實，組織藥物出現(xiàn)峰值在2周左右，血藥濃度稍遲于組織濃度出現(xiàn)峰值，在3周左右。說明鏈霉素是先通過組織，再吸收后入血液的，血液內(nèi)的峰值出現(xiàn)時間要遲于組織濃度峰值出現(xiàn)時間。避免了局部的藥物濃度較低，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。同時血液藥物濃度不至于過高，導(dǎo)致不良反應(yīng)。在這點上是鏈霉素區(qū)別于其他抗結(jié)核藥物，鏈霉素是原型的發(fā)揮抗結(jié)核作用，可以不通過血液吸收起作用。

從藥物的安全性數(shù)據(jù)顯示，在實驗的術(shù)后早期2周時、與術(shù)后晚期6周的肝腎組織病理學(xué)檢查，肝腎組織細胞形態(tài)正常，均無器質(zhì)性改變，提示無明顯的肝臟，腎臟組織損傷。通過肝腎功能檢查分析，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）指標均無明顯升高，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異（P>0.05）。說明該血藥濃度并未產(chǎn)生不良反應(yīng)，無急性、慢性肝腎功能損傷，用藥的安全性良好。

從術(shù)后影像學(xué)檢查顯示，術(shù)后1周顆粒清晰可見。術(shù)后2周左右顆粒開始模糊，提示開始出現(xiàn)崩解。術(shù)后4周時顆粒已經(jīng)變得完全模糊，成云霧狀，提示時期顆粒已經(jīng)完全崩解成細微顆粒。術(shù)后8周時顆粒已經(jīng)消失，出血骨痂逐漸形成。提示硫酸鈣已經(jīng)開始誘導(dǎo)成骨。峰值的出現(xiàn)也是在顆粒崩解過程中與大量釋放鏈霉素相關(guān)。術(shù)后病理檢查提示：骨缺損處發(fā)生炎癥反應(yīng)，見炎癥細胞、中性粒細胞長入、浸潤，毛細血管增殖。成骨細胞快速分化，逐漸形成新骨骨痂。研究認為，原理可能是硫酸鈣刺激了周圍組織的生長，包括毛細血管及細胞間質(zhì)組織的長入，同時成骨細胞附著于硫酸鈣的表面，并向植骨材料內(nèi)部逐漸爬行成骨。

本研究通過將硫酸鈣-鏈霉素緩釋系統(tǒng)顆粒植入兔子脛骨實驗顯示，藥物代謝能夠保證有效濃度的情況下，從病理學(xué)檢查上對肝腎組織的毒性反應(yīng)影響小，腎功能、肝功能檢查提示無肝腎毒性。本研究仍然存在不足，如藥物存在一定的突釋現(xiàn)象，緩釋顆粒的強度不夠，容易破碎，下一步解決方案將在后續(xù)研究中進一步改進。

[參考文獻]

[1] 德向研，施建黨，王自立，等.載三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/氨基酸聚合物人工骨體內(nèi)緩釋實驗研究[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23（6）：531-536.

[2] 劉海濤，施建黨，王騫，等.硫酸鈣/聚氨基酸復(fù)合三聯(lián)抗癆藥人工緩釋材料的制備及物理性能測定[J].中國矯形外科雜志，2015，23（21）：1984-1988.

[3] 劉海濤，王自立，施建黨.人工骨載三聯(lián)抗癆藥物含量對其抗機械壓縮強度的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，35（7）：759-762.

[4] 劉海濤，施建黨，王騫，等.載三聯(lián)抗結(jié)核藥物硫酸鈣/聚氨基酸人工材料體外緩釋性能的觀察[J].中國脊柱脊髓雜志，2015，25（3）：239-244.

[5] 張峻山，王自立，施建黨，等.復(fù)合三聯(lián)抗結(jié)核藥人工緩釋材料體外抗結(jié)核性能[J].脊柱外科雜志，2014，12（6）：380-384.

[6] Vora C，Patadia R，Mittal K，et al.Recent patents and advances on anti-tuberculosis drug delivery and formulations[J].Recent Pat Drug Deliv Formul，2017，7（2）：138-149.

[7] 羅翼，鄒昌，張帥，等.注射型可吸收氨基酸聚合物/硫酸鈣復(fù)合材料動物體內(nèi)降解吸收及促成骨作用實驗研究[J].華西醫(yī)學(xué)，2015，20（12）：2224-2228.

[8] Eva N，Paul N，F(xiàn)RC，et al. MDR tuberculosis critical steps for prevention and control[J]. N Eng J Med，2010， 363：1050-1058.

[9] 李大偉，馬遠征.骨關(guān)節(jié)結(jié)核局部藥物緩釋材料研究進展[J].中國防癆雜志，2013，35：（5）：376-378.

[10] Diacon AH，Donald PR.The early bactericidal activity of antituberculosis drugs[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2014， 12（2）：223-237.

[11] 王騫，耿廣起，叢曉明，等.載三聯(lián)抗癆藥硫酸鈣/聚氨基酸緩釋材料在兔脊柱結(jié)核模型體內(nèi)的緩釋性能[J].中國組織工程研究，2017，21（10）：1520-1526.

[12] 耿廣起，王騫，王自立，等.構(gòu)建新西蘭兔脊柱結(jié)核模型的對比研究[J].中華骨科雜志，2014，34（2）：216-223.

[13] Geng G，Wang Q，Shi J，et al.Establishment of a new Zealand rabbit model of spinal tuberculosis[J].J Spinal Disord Tech，2015，28（3）：E140-145.

[14] 普有登，湯遜.硫酸鈣骨移植替代材料的研究及應(yīng)用進展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（11）：931-933.

[15] Kumar CY，KBN，Menon J，et al. Calcium sulfate as bone graft substitute in the treatment of osseous bone defects， a prospective study[J].J Clin Diagn Res，2013，7（12）：2926-2928.

[16] 陳勇忠，王劍火，張朋，等.含鏈霉素醫(yī)用硫酸鈣人工骨修復(fù)胸腰椎結(jié)核骨缺損[J].中國組織工程研究，2014， 18（5）：802-805.

[17] 陳勇忠，王劍火，張朋，等.一期后路病灶清除混合植骨內(nèi)固定術(shù)治療胸腰椎結(jié)核[J]. 臨床骨科雜志，2014，17（6）：626-632.

[18] 龍娜，呂竹芬.微球緩釋系統(tǒng)的突釋現(xiàn)象及其影響因素[J].中國藥師，2010，13（3）：421-423.

（收稿日期：2018-09-20）