PDGF-BB/BMP-2影響種植體周圍骨形成作用的組織學(xué)觀察

周萬琳，李琳琳，劉潤(rùn)喆，李美華*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 口腔科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手術(shù)室)

種植體周圍良好的骨結(jié)合水平是種植體穩(wěn)定行使功能及維持長(zhǎng)期療效的關(guān)鍵，種植體植入后其周圍新骨的形成影響著骨結(jié)合水平。機(jī)體骨形成是多種骨形成細(xì)胞與各類骨生長(zhǎng)因子彼此協(xié)調(diào)作用的過程。作為骨形成的主要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞通過形成礦化結(jié)節(jié)以形使成骨功能，礦化結(jié)節(jié)的形成是骨組織分化成熟的標(biāo)志。茜素紅染色法通過茜素紅與礦化結(jié)節(jié)中鈣鹽的顯色反應(yīng)，從而觀察骨組織鈣鹽沉積情況[1]。Mason染色則通過對(duì)骨組織中膠原纖維的顯色以體現(xiàn)骨質(zhì)的成熟程度。目前，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨生長(zhǎng)因子的研究，血小板衍生性生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)在骨形成過程中的作用的達(dá)成了一定的共識(shí)[2]，但就PGGF和BMP對(duì)種植體周圍骨形成作用的研究與論著仍相對(duì)較少。本研究的目的在于利用茜素紅染色法及Masson染色法，觀察PDGF-BB/BMP-2及二者協(xié)同對(duì)種植體周圍成骨作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1研究對(duì)象 采用新西蘭白兔24只，無雌雄限制，體重2-2.5 kg，所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象術(shù)區(qū)無創(chuàng)傷及感染，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一管理。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器械 無菌手術(shù)巾、無菌手術(shù)手套及手術(shù)衣、手術(shù)刀、刀柄、眼科剪、骨膜剝離器、縫線、線剪、紗布、注射器、標(biāo)本瓶。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 種植體(北京萊頓公司)、種植機(jī)(日本 NSK Surgic XT Plus)、負(fù)壓吸引器(YX932D 上海無相儀器儀表有限公司)、顯微鏡(OLYMPUS BX52)、數(shù)碼相機(jī)(OLYMPUS SP610)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)、PDGF-BB及BMP-2(peprotech Company,USA)、麗春紅酸性復(fù)紅染液(上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、茜素紅染液(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備 (1)水合氯醛麻醉家兔，備皮、消毒、鋪單。沿髂骨下緣切開皮膚，逐層分離，暴露雙側(cè)髂骨。術(shù)中保證低溫生理鹽水降溫，球鉆平整骨面，逐級(jí)備洞，植入種植體，嚴(yán)密縫合肌層及皮膚。(2)將兔子隨機(jī)分為4組，每組6只，分別給予BMP-2、PDGF-BB、BMP-2+PDGF-BB及NaCl陰性對(duì)照組，保證給藥途徑及給藥時(shí)間一致，術(shù)后4組動(dòng)物食飼相同。

1.2.2標(biāo)本處理 設(shè)置3天、7天、10天為觀察節(jié)點(diǎn)，空氣栓塞法處死家兔。種植體及周圍組織于中性福爾馬林固定一周，常規(guī)石蠟包埋，切片。

1.2.3Masoon染色 組織切片XY脫蠟水化，Weigert氏鐵蘇木精染核7分鐘，充分水洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，返藍(lán)，水洗；麗春紅酸性復(fù)紅染液染色7分鐘，0.2%HOAc浸洗片刻，1%pma分化4分鐘；0.2%冰醋酸浸洗后，亮綠染色7分鐘；0.2%HOAc浸洗片刻，脫水,XY透明后中性樹膠封固。

1.2.4茜素紅染色 組織切片XY脫蠟水化，PBS滌洗(共3次，每次5 min)；甲醛固定后茜素紅染液染色5 min，快速脫水,XY透明后中性樹膠封固。

2 結(jié)果

2.1 Masson染色結(jié)果

NaCl對(duì)照組，3天時(shí)種周圍組織中可見膠原纖維呈綠色，7天、10天時(shí)纖維數(shù)量增加(圖1)；BMP-2組，3天時(shí)可見綠色纖維略少于對(duì)照組，7天、10天時(shí)可見纖維數(shù)量增多(圖2)；PDGF-BB組與對(duì)照組相比，3天時(shí)較可見多量綠色纖維，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行顯示纖維增多，修復(fù)能力增強(qiáng)(圖3)；BMP-2+PDGF-BB組與對(duì)照組相比，3天時(shí)可見綠色纖維略少，7天、10天時(shí)則可見膠原纖維數(shù)量變多、修復(fù)的能力增強(qiáng)，且高于BMP-2組(圖4)。

圖1 NaCl組各時(shí)間段纖維修復(fù)情況(標(biāo)尺示50 μm)

圖2 BMP-2組各時(shí)間段纖維修復(fù)情況(標(biāo)尺示50 μm)

圖3 PDGF-BB組各時(shí)間段纖維修復(fù)情況(標(biāo)尺示50 μm)

2.2 茜素紅染色結(jié)果

可見0.9%NaCl陰性對(duì)照組的鈣鹽礦化水平隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)無顯著變化；而PDGF-BB組與BMP-2組的鈣鹽沉積水平均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且PDGF-BB組鈣鹽礦化水平降低顯著高于BMP-2組；BMP-2+PDGF-BB組的鈣鹽沉積水平較NaCl對(duì)照組略有降低(圖5)。

圖4 BMP-2+PDGF-BB組各時(shí)間段纖維修復(fù)情況(標(biāo)尺示50 μm)

圖5 各組的鈣鹽沉積情況情況(標(biāo)尺示50 μm)

3 討論

種植體周圍骨結(jié)合被認(rèn)為是骨組織對(duì)種植體的一種結(jié)構(gòu)性反應(yīng)，從類骨質(zhì)形成到最終鈣化為成熟骨組織需要經(jīng)歷多個(gè)階段[3]。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等骨形成細(xì)胞是這一過程的主要功能單位，但目前認(rèn)為機(jī)體內(nèi)各類骨生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)骨形成的作用體系中占據(jù)主導(dǎo)作用。BMPs是一族廣泛分布于骨基質(zhì)中的低分子酸性糖蛋白多肽，其成員包括BMP-2、BMP-4及BMP-7等。其中BMP-2被認(rèn)為具備穩(wěn)定的誘導(dǎo)成骨效果，其機(jī)制主要是通過顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性，以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表型表達(dá)，改善I型膠原纖維及骨鈣素的表達(dá)水平，從而發(fā)揮促骨形成作用[4]。良好的血運(yùn)是骨組織形成、改建的關(guān)鍵，PDGF不僅能夠誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞分化增殖，還能上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)以刺激血管形成，從而發(fā)揮促進(jìn)骨組織再生的作用[5]。

本研究中，茜素紅染色結(jié)果表明隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均出現(xiàn)鈣鹽礦化、沉積的減少，考慮可能為種植手術(shù)引起周圍骨組織存在小范圍變性壞死，機(jī)體激活宿主防御機(jī)制，因而存在更多活躍的破骨細(xì)胞與多核巨噬細(xì)胞，多認(rèn)為這一現(xiàn)象是成骨細(xì)胞為類骨質(zhì)形成清除障礙，進(jìn)而加速骨改建進(jìn)程。從Masson染色結(jié)果可以觀察到，在7天、10天時(shí)，BMP-2組與PDGF-BB組的白纖維較0.9%NaCl對(duì)照組均有增加，且PDGF-BB組綠染的白纖維數(shù)量略多于BMP-2組，而茜素紅染色結(jié)果則顯示在7天、10天時(shí)BMP-2組鈣鹽沉積程度略優(yōu)于PDGF-BB組，表明可能PDGF-BB在骨形成早期的膠原纖維修復(fù)中發(fā)揮更優(yōu)作用，而BMP-2則多作用于稍晚期的骨質(zhì)礦化、成熟過程。同時(shí)可以觀察到，BMP-2+PDGF-BB組在7天、10天時(shí)，無論膠原纖維數(shù)量還是鈣鹽沉積、礦化程度均優(yōu)于BMP-2組與PDGF-BB組，表明這兩種生長(zhǎng)因子在骨修復(fù)、形成早期具備一定的協(xié)調(diào)、促進(jìn)效應(yīng)。

本研究主要通過建立兔髂骨種植模型，從組織病理學(xué)角度進(jìn)一步論證BMP-2、PDGF-BB及其二者協(xié)同在種植術(shù)后早期的促骨形成作用，以便為臨床種植工作的早期、聯(lián)合用藥提供理論支持。

[1]廖乃順，李鉆芳，林如輝，等.比較3種形態(tài)學(xué)方法觀察成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)組織工程研究,2014,18(33):5266.

[2]羅云綱,曲露露,李美華.骨形態(tài)發(fā)生蛋白與血小板衍生性生長(zhǎng)因子在骨形成中協(xié)同作用的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,39(5):1085.

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