向極釬 王曉輝 殷紅清 萬(wàn)海英 李亞杰 楊永康 叢欣

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)湘鄂5個(gè)不同區(qū)域的堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O. E. Schulz）進(jìn)行居群間遺傳多樣性分析，從50個(gè)隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)條帶清晰、多態(tài)性明顯且重復(fù)性好的引物，共擴(kuò)增出78條DNA片段，其中49條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率達(dá)62.8%。利用NTSYS 2.10軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，以相似系數(shù)0.68為標(biāo)準(zhǔn)，可將所有居群分為3類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)為自選品種鄂碎米薺1號(hào)和恩施雙河魚(yú)塘壩居群;第Ⅱ類(lèi)為宜昌長(zhǎng)陽(yáng)四方洞居群和湖南常德石門(mén)壺瓶山居群;宜昌五峰栗子坪居群獨(dú)立分為一類(lèi)。

關(guān)鍵詞：堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O. E. Schulz）;RAPD;遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0160-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.043? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Random amplified polymorphic DNA（RAPD） analysis was applied to determine the genetic diversity among 5 Cardamine violifolia O. E. Schulz samples from different region of Hubei and Hunan provinces. 10 among 50 primers were selected to amplify about 78 segments DNA， 49 polymorphic segments were found， the percentage of polymorphic probability was 62.8%. Cluster analysis using NTSYS software， a similar coefficient of 0.68 as the standard， all varieties can be divided into three categories. GroupⅠincluding C.violifolia Hubei “1” and Yutangba Shuanghe of Enshi City; GroupⅡ including Sifangdong Changyang Yichang City and Hupingshan Changde City; Liziping Wufeng Yichang City was divided into a class of independent.

Key words： Cardamine. violifolia O. E. Schulz; RAPD; genetic diversity

堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O.E. Schulz）屬十字花科（Brassicaceae）碎米薺屬（Cardamine）植物，主要分布在湘鄂武陵山區(qū)的高山溝谷溪邊，含有豐富的蛋白質(zhì)、可溶性糖、氨基酸、纖維素等營(yíng)養(yǎng)元素[1]，且具有超富集硒的特性，通過(guò)補(bǔ)硒栽培其有機(jī)硒的含量可以達(dá)到1 399.59 mg/kg WD[2]，其嫩莖、葉均可食用，在實(shí)地調(diào)查中當(dāng)?shù)鼐用穸喾Q(chēng)其為“野油菜”“水油菜”或“巖板菜”，是一種優(yōu)質(zhì)的野菜資源。

從2002年以來(lái)湘鄂武陵山區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)并命名了3種碎米薺屬植物：壺瓶山碎米薺（C. hupingshanensis L.H.Liu）[3，4]、堇葉碎米薺（C. violifolia O.E. Schulz）[5]和恩施碎米薺（C. enshiensis Y.Y.Wu & T.Y.Xiang）[6]，由于從外部形態(tài)上無(wú)法區(qū)分該種植物及其地域性，同時(shí)出現(xiàn)了同種異名的現(xiàn)象，造成研究上的重復(fù)，雖然有學(xué)者將這3種碎米薺歸為同一個(gè)種[7]，但并未給出分子生物學(xué)上的依據(jù)。2014年有學(xué)者分別從4個(gè)有代表性的地點(diǎn)（恩施雙河、宜昌五峰、宜昌長(zhǎng)陽(yáng)和石門(mén)壺瓶山）采集不同居群的壺瓶山碎米薺、恩施碎米薺和堇葉碎米薺，通過(guò)nrDNA ITS序列分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)居群間的碎米薺遺傳距離在0～0.003，說(shuō)明了4個(gè)不同區(qū)域的碎米薺為同一個(gè)種，統(tǒng)稱(chēng)為堇葉碎米薺[8]。

RAPD（Random amplification of polymorphic）標(biāo)記是利用一個(gè)10堿基序列的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增的多態(tài)性來(lái)檢測(cè)供試材料基因組間的遺傳變異[9]。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在十字花科蔬菜研究中應(yīng)用廣泛，在檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的方面具有快速、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于十字花科蔬菜的品種鑒定、分類(lèi)與演化、親緣關(guān)系與遺傳多樣性等各個(gè)領(lǐng)域的研究。Mailer等[10]利用RAPD方法鑒定了澳大利亞甘藍(lán)型油菜所有品種，利用100個(gè)引物對(duì)23個(gè)油菜品種進(jìn)行RAPD分析，其中70個(gè)引物產(chǎn)生了DNA電泳條帶，20個(gè)表現(xiàn)出多態(tài)性，6個(gè)引物就可以區(qū)分23個(gè)油菜品種。Hu等[11]用4個(gè)隨機(jī)引物對(duì)14個(gè)青花菜品種和12個(gè)花椰菜品種進(jìn)行RAPD檢測(cè)，結(jié)果表明，2個(gè)引物就足以鑒定或區(qū)別14個(gè)青花菜品種，3個(gè)引物就足以區(qū)分12個(gè)花椰菜品種。喬愛(ài)明等[12]對(duì)8個(gè)芥菜變種的16個(gè)品種（每個(gè)變種有2個(gè)品種）進(jìn)行RAPD鑒定，結(jié)果表明，篩選出了7個(gè)有效引物在16個(gè)品種上都有特征DNA條帶。

本試驗(yàn)以湘鄂4個(gè)不同居群的堇葉碎米薺和自選的堇葉碎米薺品種鄂碎米薺1號(hào)為材料，通過(guò)RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同居群間的堇葉碎米薺在全基因組層面進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以期發(fā)現(xiàn)不同居群間的堇葉碎米薺是否存在差異，并嘗試篩選可用于湘鄂不同區(qū)域堇葉碎米薺居群鑒別的引物，為今后該超聚硒植物的多樣性保護(hù)和遺傳親本選配，以及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試樣品? 供試樣品為在2017年收集的湘鄂5個(gè)不同區(qū)域堇葉碎米薺居群50株混合鮮葉，采樣信息見(jiàn)表1。

1.1.2? 主要儀器? 高壓蒸汽滅菌鍋（上海東亞容器01J2003-04）、超低溫冰箱（SANYO MDF-392）、冰箱（Hair 208K/ANCINA）、制冰機(jī)（SCOTSMAN DA24845-3）、PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf 5331）、高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 5417R）、電泳儀（北京六一DYY-4C）、渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries Vortex-Genie 2）、電子天平（賽多利斯Secura？誖）、凝膠成像系儀器（美國(guó)伯樂(lè)Gel Doc 200）、超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析TU-1810）。

1.1.3? 主要試劑? 試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的RAPD引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增所用試劑購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 基因組DNA提取? 堇葉碎米薺DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extration Kit，用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的純度與濃度。

1.2.2? RAPD PCR擴(kuò)增? 反應(yīng)體系總體積25 μL，含有1 μL基因組DNA（30 ng），1 μL引物（5 μmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer反應(yīng)緩沖液，2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.2 μL Taq酶，用ddH2O補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，35.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳35 min，在凝膠成像儀上觀察照相、記錄。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各分子在相同電泳遷移率（相對(duì)分子質(zhì)量片段）的有無(wú)，統(tǒng)計(jì)得到所有條帶的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴(kuò)增條帶記為1，無(wú)帶記為0，利用Ntsys 2.10計(jì)算出遺傳相似系數(shù)、構(gòu)建聚類(lèi)圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 堇葉碎米薺基因組DNA提取

由圖1可以看出，提取的DNA經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰。由表2可知，提取的堇葉碎米薺的基因組DNA OD值和含量正常，表明DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2? 引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

從50個(gè)隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)條帶清晰、多態(tài)性明顯并且重復(fù)性好的引物（表3）。10個(gè)引物共擴(kuò)增出78條DNA片段，其中49條為多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增條帶數(shù)的62.8%。RAPD引物S02的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3? 遺傳相似性分析

利用RAPD標(biāo)記擴(kuò)增DNA片段，通過(guò)Ntsys計(jì)算出遺傳相似系數(shù)（GS）。RAPD標(biāo)記表明，5個(gè)區(qū)域堇葉碎米薺居群間的遺傳相似系數(shù)在0.076 0～0.804 5（表4），平均值為0.440 3。其中，恩施州農(nóng)科院產(chǎn)業(yè)園自選品種鄂碎米薺1號(hào)（ES）與雙河魚(yú)塘壩硒礦區(qū)（SH）GS值最大，為0.804 5，宜昌的五峰縣（WF）與宜昌長(zhǎng)陽(yáng)縣（CY）GS最小，為0.076 0。

2.4? 聚類(lèi)分析結(jié)果

由圖3可知，以相似系數(shù)0.68為標(biāo)準(zhǔn)，可將5個(gè)不同區(qū)域的堇葉碎米薺分為3大類(lèi)，第Ⅰ大類(lèi)包括恩施州農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范園自選品種鄂碎米薺1號(hào)（ES）和恩施雙河魚(yú)塘壩（SH），第Ⅱ類(lèi)包括宜昌長(zhǎng)陽(yáng)四方洞（CY）和湖南石門(mén)壺瓶山（HPS）;宜昌的五峰栗子坪（WF）獨(dú)立分為一類(lèi)。

3? 討論

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是利用10個(gè)堿基的隨機(jī)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)DNA多態(tài)性的技術(shù)[13]。RAPD與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比具有眾多的優(yōu)越性：引物可以隨機(jī)設(shè)計(jì)，并可用于不同樣本基因組多樣性檢測(cè)分析，具有廣泛性和通用性，且試驗(yàn)費(fèi)用低;可檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)是無(wú)限的，靈敏度高，能夠檢測(cè)出不同樣本間的微小差異;所需檢測(cè)樣本DNA用量少，純度要求不高，試驗(yàn)過(guò)程中不需要進(jìn)行額外的Southern轉(zhuǎn)移、分子雜交等繁瑣的程序，可同時(shí)檢測(cè)大量樣本。

本試驗(yàn)以湘鄂地區(qū)5個(gè)不同區(qū)域堇葉碎米薺居群為供試材料，從50個(gè)隨機(jī)RAPD引物中成功篩選出10個(gè)有效引物，結(jié)果反映5個(gè)不同區(qū)域的堇葉碎米薺在居群間存在一定的差異，而且這種差異是可以通過(guò)RAPD標(biāo)記技術(shù)顯示出來(lái)的，這為應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行堇葉碎米薺遺傳多樣性分析和居群間分子鑒別等研究提供理了論基礎(chǔ)。構(gòu)建的聚類(lèi)圖可以反映親緣關(guān)系與地理分布的相關(guān)性，本試驗(yàn)中恩施雙河魚(yú)塘壩的堇葉碎米薺和自選品種鄂碎米薺1號(hào)聚為一類(lèi)，這可能是由于自選品種是多年來(lái)對(duì)雙河魚(yú)塘壩區(qū)域堇葉碎米薺進(jìn)行的野轉(zhuǎn)家栽培和品種選育使它們之間的基因組差異不顯著造成的，這種親緣關(guān)系與地理分布的聯(lián)系也與朱莉等[14]對(duì)湖北、湖南白菜型油菜品種的RAPD分析中得到的結(jié)果相類(lèi)似。通過(guò)全面的分析湘鄂地區(qū)堇葉碎米薺種質(zhì)資源的變化，有利于選育更加優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，為今后更好地開(kāi)發(fā)利用該野生植物資源以期將其申報(bào)為新食品原料服務(wù)于人們的健康，以及利用生物技術(shù)進(jìn)行該獨(dú)特資源硒富集途徑關(guān)鍵基因的克隆和表達(dá)的基礎(chǔ)研究提供了可靠的材料基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)由于采集的樣本只限于湘鄂西部臨近地區(qū)，C. violifolia O.E.Schuiz已被處理為露珠碎米芥C. circaeoides J.D.Hooke被視為同物異名[15]，采樣的范圍沒(méi)有擴(kuò)大到全國(guó)該植物的多數(shù)分布區(qū)域，造成本試驗(yàn)結(jié)果只適用于湘鄂地區(qū)的堇葉碎米薺的研究，但這為以后能更全面地進(jìn)行該植物的研究分析奠定了前期基礎(chǔ)，同時(shí)該種植物的起源中心和不同區(qū)域的遺產(chǎn)變異類(lèi)型還有待進(jìn)一步探索和研究。

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