尹利方，陳澤斌，夏體淵，王定康，姚麗媛，華金珠，徐勝光，王家銀

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214; 3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

表1 所用PCR引物

【研究意義】隨著中國(guó)工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，城市污水的入湖量不斷增加，河口和近岸海域氮磷負(fù)荷逐年增加，近岸水質(zhì)持續(xù)下降，富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致了一系列的環(huán)境問(wèn)題，如頻繁的赤潮和水華。滇池是中國(guó)著名的高原淡水湖泊，水污染嚴(yán)重，氮磷有機(jī)污染嚴(yán)重超標(biāo)，水質(zhì)為V類(lèi)水體，嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在過(guò)去幾十年里，圍繞滇池開(kāi)展的研究多為非點(diǎn)源污染控制、地球化學(xué)和生態(tài)學(xué)方面，而水體和沉積物中微生物的研究十分匱乏。甲烷(CH4)是產(chǎn)甲烷菌在厭氧條件下分解有機(jī)物產(chǎn)生的溫室氣體，它對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)僅次于二氧化碳[1]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，甲烷的溫室效應(yīng)已達(dá)20 %，并以每年0.8 %～1 %的速度增長(zhǎng)，在溫室效應(yīng)中起著越來(lái)越重要的作用[2]。目前對(duì)湖泊甲烷釋放總量的研究主要集中在源和匯上，在低溫下，大型淡水湖泊是大氣CH4的來(lái)源，來(lái)源于沉積物中的產(chǎn)甲烷古菌，它在厭氧條件下產(chǎn)生和釋放甲烷[3]。因此，為全面了解甲烷排放的來(lái)源。有必要研究湖泊沉積物中甲烷菌群落結(jié)構(gòu)，為湖泊沉積物CH4排放的準(zhǔn)確估算提供數(shù)據(jù)支持。反硝化作用在水體氮循環(huán)系統(tǒng)中起著重要作用。在此過(guò)程中，反硝化細(xì)菌受到缺氧外部條件的影響，將硝酸鹽或亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蛞谎趸?，并將其釋放到大氣中，減少了水體中氮元素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，對(duì)滇池沉積物中反硝化細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究，可為微生物對(duì)反硝化作用的調(diào)控、反硝化作用的時(shí)空耦合效應(yīng)和區(qū)域氮素生物地球化學(xué)循環(huán)模式的建立提供理論依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】文章以滇池沉積物為研究對(duì)象，采用克隆文庫(kù)的分子克隆方法，研究產(chǎn)甲烷菌和反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)，從而使人們對(duì)滇池富營(yíng)養(yǎng)化和甲烷排放的機(jī)制有更全面的認(rèn)識(shí)，為滇池水體修復(fù)提供生物學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

沉積物樣品DC6于2017年1月采集自滇池草海，采用抓斗式底泥采樣器在緯度N24°55′59″，經(jīng)度E102°41′8″位點(diǎn)分別進(jìn)行3次重復(fù)采樣，重復(fù)之間間隔10 m，重復(fù)樣品混勻后裝入滅菌的250 mL錐形瓶，用于總DNA的提取。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

按陳澤斌等[4]的方法提取沉積物總DNA，采用引物NirS1F / NirS6R和Me1 / Me2分別對(duì)沉積物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)，得到反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段。PCR反應(yīng)體系及條件參照周麗[5]和楊秀清[6]的文獻(xiàn)，取5 μl PCR產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 克隆與測(cè)序

回收PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa)，按載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。用菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆(PCR反應(yīng)體系和條件同1.2)，陽(yáng)性克隆測(cè)序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Mothur軟件按相似性(>97 %)將測(cè)得序列劃分為不同操作分類(lèi)單元(OTU)并計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率(C)[7]；用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中完成序列比對(duì)[8]；用MEGA軟件生成序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段的電泳檢測(cè)

用表1列出的引物對(duì)反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)(圖1)，分別得到長(zhǎng)度分別為1000和760 bp的單一片段，這與周麗[5]和楊秀清[6]的報(bào)道一致。反硝化細(xì)菌特異性片段濃度較低，低于50 ng/μl，產(chǎn)甲烷菌特異性片段濃度較高，高于100 ng/μl。試驗(yàn)證實(shí)了滇池沉積物中存在反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌，且產(chǎn)甲烷菌的豐度高于反硝化細(xì)菌。

2.2 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)

分別在2個(gè)克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑取100個(gè)菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得的陽(yáng)性克隆子數(shù)分別為55和99個(gè)(表2)，說(shuō)明反硝化細(xì)菌克隆文庫(kù)中克隆子陽(yáng)性率偏低，約為55.00 %，這可能與2.1中PCR擴(kuò)增得到的反硝化細(xì)菌特異性片段的濃度較低有關(guān)，導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低，大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌；2.1中PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl)，其克隆文庫(kù)的陽(yáng)性率也高，約為99.00 %。Mothur軟件按大于97 %的相似性將2個(gè)克隆文庫(kù)的測(cè)得序列分別劃分為10個(gè)和5個(gè)OUT(表2)，說(shuō)明盡管反硝化細(xì)菌的豐度低于產(chǎn)甲烷菌，但物種多樣性高于產(chǎn)甲烷菌。2個(gè)文庫(kù)的覆蓋率分別為81.82 %和94.95 %(表2)，均大于80 %，說(shuō)明構(gòu)建的2個(gè)文庫(kù)有效，測(cè)序深度適宜，可以代表沉積物中反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的物種多樣性。

a:反硝化細(xì)菌特異性片段電泳圖；b:產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳圖；M:5 μl DL2000 DNA Marker；1、2、3-泳道a:Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria; b:Specific fragment electrophoresis map of methanogenic bacteria; M:5 μl DL2000 DNA Marker; 1,2,3:Lane圖1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳Fig.1 Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria and methanogenic bacteria

2.3 反硝化細(xì)菌克隆文庫(kù)中代表序列的BLASTN比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表3)，從55個(gè)陽(yáng)性克隆子中選出10個(gè)代表序列(圖2)，并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)55個(gè)陽(yáng)性克隆子可分為10個(gè)種類(lèi)：OTU1(代表序列為1-6-1，占比1.82 %)類(lèi)序列與從污泥中一株未培養(yǎng)細(xì)菌CYCU的以亞硝酸鹽還原酶基因序列相似性達(dá)91 %[10]，說(shuō)明該類(lèi)菌株具有反硝化活性，但其分類(lèi)地位未能準(zhǔn)確鑒定；OTU2(1-6-22，1.82 %)類(lèi)序列與Pandoraeafaecigallinarum的相似性達(dá)94 %；OTU3(1-6-20，1.82 %)類(lèi)序列與水稻土中對(duì)異化鐵還原反應(yīng)的貢獻(xiàn)最大的優(yōu)勢(shì)菌群Geoalkalibactersubterraneus的相似性達(dá)81 %[11]，是潛在的未知種類(lèi)；OTU4(1-6-33，10.91 %)類(lèi)序列與廢水活性污泥細(xì)菌Steroidobacterdenitrificans的相似性達(dá)82 %[12]；OTU5(1-6-15，1.82)類(lèi)序列與有光異養(yǎng)制氫特性的細(xì)菌Rubrivivaxgelatinosus相似性達(dá)80 %[13]；OTU6(1-6-27，7.28 %)類(lèi)序列與Azoarcussp.的相似性達(dá)80 %；OTU7(1-6-38，7.28 %)類(lèi)序列與Polymorphumgilvum的相似性達(dá)81 %；OTU8(1-6-41，10.91 %)類(lèi)序列與Sulfuritaleahydrogenivorans的相似性達(dá)79 %；OTU9(1-6-84，3.64 %)類(lèi)序列與具有甲苯降解特性的Thauerasp.相似性達(dá)82 %[14]；OTU10(1-6-4，52.73)類(lèi)序列與污水處理廠(chǎng)尾水中細(xì)菌Dechloromonasaromatica的相似性達(dá)86 %[15]，該類(lèi)群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群；OTU1、OTU2、OTU3、OTU5、OTU9類(lèi)序列的發(fā)現(xiàn)頻率較低，為反硝化細(xì)菌中的低豐度類(lèi)群。

表2 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫(kù)分析

表3 反硝化細(xì)菌特異性片段克隆文庫(kù)中各OUT代表序列分析

粗體和下劃線(xiàn)標(biāo)記的序列為代表序列，下同Bold and underlined sequences were representative sequences. The same as below圖2 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

2.4 產(chǎn)甲烷菌克隆文庫(kù)中代表序列的BLASTN比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表4)，從99個(gè)陽(yáng)性克隆子中選出5個(gè)代表序列(圖3)，并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)99個(gè)陽(yáng)性克隆子可分為5個(gè)種類(lèi)：OTU1(I073，1.01 %)類(lèi)序列與水稻土及污泥中大量存在的Methanobacteriumoryzae相似性達(dá)85 %[16]；OTU2(H10，1.01 %)類(lèi)序列與利用氫和甲酸的產(chǎn)甲烷菌甲酸甲烷桿菌(Methanobacteriumformicicum)相似性達(dá)85 %[17]；OTU3(E12，3.03 %)類(lèi)序列與酸性泥炭沼澤中大量存在的CandidatusMethanoregulaboonei相似性達(dá)85 %[18]；OTU4(E07，3.03 %)類(lèi)序列與采油廢水中檢測(cè)到的Methanolineatarda相似性達(dá)86 %。OTU5(H012, 91.92 %)類(lèi)序列與甲酸甲烷規(guī)則菌(Methanoregulaformicicum)相似性達(dá)86 %，該類(lèi)群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，該類(lèi)群也是最早被報(bào)道的產(chǎn)甲烷微生物；OTU1、OTU2為反硝化細(xì)菌中的低豐度類(lèi)群。

表4 產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫(kù)中各OUT代表序列分析

圖3 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

3 討 論

本研究測(cè)得的154條克隆子序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知可培養(yǎng)菌株的相似性在79 %～94 %，98.7 %的序列與可培養(yǎng)菌株的相似性低于90 %，說(shuō)明滇池沉積物中的反硝化細(xì)菌與產(chǎn)甲烷菌多為潛在的未被培養(yǎng)的新種，相似的可培養(yǎng)群落多來(lái)自于污泥、水稻土、廢水和沼澤，這與前人的研究報(bào)道一致。

研究得到的反硝化細(xì)菌序列全部歸屬于Proteobacteria門(mén)，這與大量反硝化菌屬于Betaproteobacteria綱的報(bào)道相符合[19]。與文庫(kù)中序列相似的可培養(yǎng)微生物屬于Pandoraea屬(1.82 %)、Thauera屬(3.64 %)、Geoalkalibacter屬(1.82 %)、Steroidobacter屬(1.82 %)、Rubrivivax屬(1.82 %)、Azoarcus屬(7.28 %)和Polymorphumgilvum屬等，在以往的研究中，這些屬也作為反硝化細(xì)菌被報(bào)道[20]。

在《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版中，產(chǎn)甲烷菌的分類(lèi)包括甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)共5個(gè)目，本研究得到的所有序列都?xì)w屬于甲烷桿菌目，未檢測(cè)到其他目的產(chǎn)甲烷菌種類(lèi)。據(jù)報(bào)道，甲烷桿菌目微生物能以H2、CO2、甲酸鹽和甲醇為代謝底物，產(chǎn)生甲烷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)的Methanoregula屬微生物被報(bào)道是泥炭蘚濕地土壤中優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)甲烷菌類(lèi)群[22]。

本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)目的片段的克隆得到了啟示：通過(guò)PCR獲得的目的片段如果要克隆到載體上，連接體系中目的片段的濃度必須要達(dá)到要求。例如反硝化細(xì)菌特異性片段濃度過(guò)低導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低，大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，文庫(kù)中克隆子陽(yáng)性率偏低。相反，產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl)，其克隆文庫(kù)的陽(yáng)性率也高，約為99.00 %。

本研究只采用引物Me1/Me2對(duì)產(chǎn)甲烷菌的多樣性進(jìn)行研究，尚且存在不足。Banning[23]和Juottonen[24]等人研究指出，Mcr引物和Me引物在檢測(cè)產(chǎn)甲烷菌檢測(cè)中具有不同的靈敏度。Me引物無(wú)法檢測(cè)到產(chǎn)甲烷菌中的Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae類(lèi)群，導(dǎo)致研究結(jié)果不能覆蓋全部物種，這與本研究的結(jié)果一致。因此，為了全面準(zhǔn)確的評(píng)估環(huán)境中的產(chǎn)甲烷菌的多樣性，需要選用多對(duì)引物進(jìn)行研究，其次，還應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，生理生化鑒定方法，才能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

4 結(jié) 論

隨著厭氧培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的群體研究會(huì)更加詳細(xì)和全面。今后的相關(guān)研究可以集中在以下2個(gè)方面：首先，可以通過(guò)改進(jìn)微生物分類(lèi)技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的產(chǎn)甲烷菌群；其次，對(duì)產(chǎn)甲烷菌的代謝特征進(jìn)行更詳細(xì)的研究，為環(huán)境治理和生物能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

[1]張堅(jiān)超, 徐鐿欽, 陸雅海. 陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過(guò)程的微生物機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(20): 6592-6603.

[2]周 煒, 張?jiān)婪? 朱普平, 等. 種植制度對(duì)長(zhǎng)江下游稻田溫室氣體排放的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 35-41.

[3]王琛瑞, 黃國(guó)宏, 梁戰(zhàn)備, 等. 大氣甲烷的源和匯與土壤氧化(吸收)甲烷研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2002, 13(12): 1707-1712.

[4]陳澤斌, 夏體淵, 王定康, 等. 滇池沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌分布的時(shí)空差異[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2016, 40(2): 425-430.

[5]周 麗, 付智丹, 杜 青, 等. 減量施氮對(duì)玉米/大豆套作系統(tǒng)中作物氮素吸收及土壤氨氧化與反硝化細(xì)菌多樣性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(6): 1076-1087.

[6]楊秀清, 吳瑞薇, 韓作穎, 等. 基于mcrA基因的沁水盆地煤層氣田產(chǎn)甲烷菌群與途徑分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2017, 44(4): 795-806.

[7]嚴(yán)立恩, 陳志榮, 王晶晶, 等. 南極喬治王島陸地土壤和潮間帶放線(xiàn)菌多樣性及其抑菌活性研究[J]. 中國(guó)海洋藥物, 2016, 35(1): 19-28.

[8]尹利方, 任 禛, 夏體淵, 等. 應(yīng)用克隆文庫(kù)構(gòu)建法研究枇杷根系A(chǔ)MF多樣性[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 30(5): 1009-1015.

[9]尹利方, 陳澤斌, 夏體淵, 等. 一株鐵皮石斛組織培養(yǎng)污染內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 29(8): 1982-1986.

[10]You S J. Identification of Denitrifying Bacteria Diversity in an Activated Sludge System by using Nitrite Reductase Genes[J]. Biotechnology Letters, 2005, 27(19): 1477-1482.

[11]王媛媛. 磷酸鹽對(duì)水稻土中異化鐵還原菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

[12]蒙小俊, 李海波, 曹宏斌, 等. 焦化廢水活性污泥細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2016, 37(10): 3923-3930.

[13]Ru Y L, Fang H H P. Hydrogen production characteristics of photoheterotrophicRubrivivaxgelatinosus, L31[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2008, 33(3): 974-980.

[14]徐愛(ài)玲, 任 杰, 宋志文, 等. 污水處理廠(chǎng)尾水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2014(9): 3473-3479.

[15]Joulian C, Patel B K C, Ollivier B, et al.Methanobacteriumoryzaesp. nov. a novel methanogenic rod isolated from a Philippines ricefield.[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2000, 50 Pt 2(2): 525-528.

[16]穆維娜, 李玉成, 武 超, 等. 秸稈藍(lán)藻混合發(fā)酵產(chǎn)沼氣過(guò)程中微生物群落分析[J]. 微生物學(xué)雜志, 2017, 37(1): 70-77.

[17]Br?uer S L, Cadillo-Quiroz H, Ward R J, et al.Methanoregulabooneigen. nov. sp. nov. an acidiphilic methanogen isolated from an acidic peat bog[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2011, 61(Pt1): 45.

[18]穆 劍, 匡 麗, 高迎新, 等. 采油廢水厭氧處理系統(tǒng)的微生物群落特征[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2014, 8(3): 807-814.

[19]洪 璇, 洪有為, 陳仲巍, 等. 九龍江河口區(qū)nirS型反硝化細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2015, 42(9): 1639-1650.

[20]方晶晶, 馬傳明, 劉存富. 反硝化細(xì)菌研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2010(s1): 206-210.

[21]馬 凱. 產(chǎn)甲烷菌的分子系統(tǒng)學(xué)和生態(tài)功能研究[D]. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所, 2006.

[22]曾志華. 閩江河口區(qū)鹽度梯度下潮汐沼澤濕地產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)及對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)[D]. 福建師范大學(xué), 2014.

[23]Banning N, Brock F, Fry J C, et al. Investigation of the methanogen population structure and activity in a brackish lake sediment[J]. Environmental Microbiology, 2005, 7(7): 947.

[24]Juottonen H, Galand P E, Yrj?l? K. Detection of methanogenic Archaea in peat: comparison of PCR primers targeting the mcrA gene[J]. Research in Microbiology, 2006, 157(10): 914.