張帆帆，李龍顯＊，葉 昱，李 凱，郭楠楠，張 敏，黃冬艷，吳 瓊，何后軍，宋德平*，唐玉新*

(1.江西農業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045;2.江西農業(yè)大學 畜禽防治研究所，江西 南昌 330045)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)最早由德國學者從傳代的PK15細胞中發(fā)現(xiàn)并分離，當時發(fā)現(xiàn)的是不致病的豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV-1)[1]。后來加拿大學者報道了仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的出現(xiàn)，并證實PCV-2為主要病原；此后，PCV-2在全世界分布廣泛，引起PMWS、皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征、繁殖障礙、增生性壞死性肺炎(PNP)等豬圓環(huán)病毒相關疾病(PCVAD)，是威脅世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一[2]。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)不斷走向現(xiàn)代化、超大規(guī)?；滦筒《镜陌l(fā)現(xiàn)及混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[3-6]。2016年，美國學者Palinski和Phan在利用高通量測序方法從暴發(fā)皮炎腎病綜合征和繁殖障礙的母豬及其流產胎兒樣品中發(fā)現(xiàn)了一種新的圓環(huán)病毒亞型——豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV-3)[7-8]。

據(jù)報道，PCV-3可導致母豬厭食、皮炎腎病綜合征、繁殖障礙，如流產、產木乃伊胎、死胎、弱仔等癥狀，其癥狀與PCV-2相似；由于PCV-3可從患有PDNS癥狀母豬及其流產胎兒體內檢出，間接證明PCV-3具有垂直傳播的特性；同時有研究表明該病毒可通過公豬精液傳播[7-9]。在我國，新現(xiàn)的PCV-3也被檢出和報道。Fan等[10]報道從湖北和廣東發(fā)生繁殖障礙的母豬和急性死亡仔豬體內發(fā)現(xiàn)了該病毒。Shen等[11]和Ku等[12]報道表明我國已有13個省的豬群中都感染了PCV-3，主要分布在中東部地區(qū)。Ku等[12]報道的通過普通PCR從遼寧、重慶3個豬場中的222份樣品中發(fā)現(xiàn)，PCV-3和PCV-2單獨感染率各為62.2%和34.7%，混合感染率為15.8%。

鑒于PCV-3和PCV-2所引起的疾病癥狀非常相似，在臨床上很難區(qū)分，且PCV-3呈現(xiàn)多地域感染的現(xiàn)狀，建立快速、準確的鑒別PCV-3和PCV-2的方法是有效診斷和防控我省豬群感染PCV-3和PCV-2的基礎。本研究擬建立檢測PCV-3和PCV-2的雙重PCR，并對疑似圓環(huán)病毒感染的豬只樣品進行檢測，以了解江西地區(qū)PCV-3及其與PCV-2混合感染情況，為新現(xiàn)PCV-3感染的流行病學調查及臨床診斷提供切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 病料及主要試劑

1.1.1 樣品與病毒 2016—2017年采自江西省南昌、九江、宜春、撫州、新余、贛州、吉安7個地區(qū)有繁殖障礙豬呼吸道疾病綜合征、體質量下降的豬群的組織器官；PCV-1、PCV-2、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、PDCoV、TGEV、PAstV等病毒陽性樣品于本實驗室鑒定和保存，PCV-3陽性樣品來源于檢測測序鑒定為陽性的樣品。

1.1.2 主要試劑 平衡酚、Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA marker、dNTP Mixture、膠回收試劑盒及pMD-18T載體等均購置Takara(大連)公司，TOP10感受態(tài)細胞購自北京天根生化有限公司。

1.2 引物設計

用 MEGA 6.0比對GenBank數(shù)據(jù)庫目前所有的PCV-2、PCV-3的ORF2基因序列，根據(jù)其保守序列用Primer 3.0在線軟件分別設計了1對擴增PCV-2、PCV-3 ORF2基因片段的特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.3 病毒核酸的提取

病料按1∶2體積用0.01 mol/L pH 7.0 PBS稀釋后勻漿，反復凍融3次；凍融好的樣品渦旋3～5 min，8 000×g離心10 min；取400 μL上清液加500 μL細胞裂解液，37 ℃孵育30 min后加入500 μL平衡酚，連續(xù)劇烈震蕩15 s后靜置2 min；10 000×g離心5 min；吸取400 μL上清液至新的無菌EP管中，加入500 μL氯仿/異戊醇(24∶1)，漩渦振蕩混勻，常溫靜置5 min；10 000×g離心5 min；吸取上清200 μL加入500 μL無水乙醇、10 μL 3 mol/L醋酸鈉，輕輕上下顛倒混勻；10 000×g離心5 min，棄上清；沉淀加入1 mL 4 ℃的75%乙醇，10 000×g離心5 min，棄上清；室溫放置5 min，沉淀(即DNA)用30 μL ddH2O水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 聚合酶鏈式反應

以提取的DNA為模板，用引物PCV-2-F/R、PCV-3-F/R進行PCR擴增。PCR體系：2.5 μL DNA模板，1 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 ×PCR Buffer，1 μL上游/下游引物(10 μmol/L)，0.3 μL Ex Taq(5 U/μL)，加DEPC處理的滅菌ddH2O至25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結果。陽性PCR產物經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體，轉入TOP 10感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定后挑選陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 PCR特異性試驗

應用建立的方法，以PCV-2、PCV-3、PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV及CSFV核酸為模板進行PCR擴增，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結果。

1.6 PCR敏感性試驗

將1.4中獲得的陽性重組菌擴大培養(yǎng)后提取質粒，通過超微量分光光度計Nanodrop 2000測定提取的重組質粒的濃度，再根據(jù)重組質粒分子質量和阿伏伽德羅常數(shù)將質粒濃度換算成單位體積分子拷貝數(shù)，并將重組質粒稀釋成1.0×108拷貝/μL的原始濃度后進行10倍梯度稀釋，以1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝/μL為模板進行PCR擴增以檢驗建立的PCR方法的靈敏度。

1.7 PCR重復性試驗

應用上述建立的雙重PCR檢測方法，選取同一陽性病料DNA為模板，每隔1周重復1次，檢測3次，以確定檢測方法的可靠性和重復性。

1.8 臨床腹瀉樣品的檢測

應用建立的RT-PCR方法檢測2016—2017年從江西各地區(qū)豬場采集的265份疑似豬圓環(huán)病毒感染的病料組織中PCV-3和PCV-2存在情況。

2 結果與分析

2.1 雙重PCR擴增結果

利用PCV-3和PCV-2的特異性引物分別對PCV-3和PCV-2進行PCR擴增，并對PCV-3和PCV-2進行雙重PCR擴增，結果表明，單項PCR和多重PCR均能擴增出約408 bp和248 bp的片段(圖1)，與預期結果一致。

2.2 PCR產物的克隆與測序分析

將擴增為PCV-3和PCV-2陽性的PCR產物回收、克隆后進行測序，將獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行BLAST比對分析；結果表明擴增得到的疑似PCV-2片段序列與KY806069、KU960929、KY305204毒株序列的同源性高達99%，擴增出的疑似PCV-3片段序列與KX778720、MF069116、KY075989、MF162299的同源性也為99%，證明所擴增的片段分別為PCV-3和PCV-2。

2.3 特異性試驗

為檢驗建立的多重PCR方法的特異性，以PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV及CSFV核酸為模板，用所設計的引物進行RT-PCR/PCR擴增。結果發(fā)現(xiàn)(圖2)，這些以非PCV-3和PCV-2為模板的樣品均為陰性，只有PCV-2、PCV-3陽性病料可分別擴增出約為248 bp和408 bp的目的片段，表明該檢測方法特異性良好。

1：PCV-3和PCV-2的雙重PCR擴增產物；2：PCV-2單重PCR擴增產物；3：PCV-3單重PCR擴增產物；4：陰性對照；M：DNA Marker DL 20001:The amplification product of PCV-2 and PCV-3;2:The amplification product of PCV-2；3:The amplification product of PCV-3;4：Negative control;M:DNA Marker DL 2000圖1 PCV-3和PCV-2單一和雙重PCR擴增Fig.1 The single and dulex PCR products of PCV-3 and PCV-2

1：PCV-2單重PCR擴增產物；2：PCV-3單重PCR擴增產物；3：PCV-3和PCV-2雙重PCR擴增產物；4～9：PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的擴增產物；10：陰性對照；M：DNA Marker DL 20001:The amplification product of PCV-2；2:The amplification product of PCV-3;3:The amplification product of PCV-2 and PCV-3;4-9：The PCR products of PRV、PDCoV、PEDV、TGEV、PRRSV and CSFV;10：Negative control;M:DNA Marker DL 2000圖2 多重PCR特異性試驗Fig.2 Validation of the specificity of the duplex PCR for PCV-2 and PCV-3 detection

2.4 敏感性試驗

1-9：1.0×108～1.0×100拷貝/μL；10：陰性對照；M：DNA Marker DL 20001-9：1.0×108～1.0×100 copies/μL；10：Negative control；M：DNA Marker DL 2000圖3 雙重PCR敏感性試驗Fig.3 Validation of the sensitivity of the duplex PCR

以重組質粒1.0×108拷貝/μL的原始濃度后進行10倍梯度稀釋后作為模板，以檢測所建立的雙重PCR對PCV-3和PCV-2的最低檢測量，發(fā)現(xiàn)兩者的最低檢測量均為1.0×103拷貝/μL(圖3)。

2.5 重復性試驗

利用建立的PCV-3和PCV-2雙重PCR檢測方法，以不同時間段連續(xù)擴增三次，結果表明(圖4)，建立的方法具有較好的重復性。

2.6 臨床樣品檢測

應用建立的PCR方法檢測2016—2017年從江西各地區(qū)豬場采集的256份疑似豬圓環(huán)病毒感染的組織樣品中的PCV-3和PCV-2感染情況。結果顯示(圖5)，PCV-2的陽性率較高，為86.3%(221/256)；2份樣品為PCV-3陽性，陽性率為0.78%；其中1份PCV-3和PCV-2混合感染，混合感染率為0.39%。

A、B和C分別代表第一、二和三周的PCR；1：PCV-2；2：PCV-3；3：PCV-3和PCV-2；4：陰性對照；M：DNA Marker DL 2000A,B and C:The first,second and third week of PCR,respectively;1:PCV-2;2:PCV-3;3:PCV-2 and PCV-3;M:DNA Marker DL 2000圖4 雙重PCR的重復性試驗Fig.4 Validation of the repeatability of the duplex PCR

1-24：部分臨床樣品雙重PCR檢測結果；M：DNA Marker DL 20001-24:PCV-2 and PCV-3 PCR results of representative samples of pig;M:DNA Marker DL 2000圖5 部分臨床樣品PCR檢測Fig.5 PCR results of representative diarrheal samples of pigs

3 結論與討論

PCV-3是近年來新發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒亞型，可引起母豬繁殖障礙、流產，可感染公豬，并通過精液傳播等，是豬群新現(xiàn)的重要病原[12-13]。目前，PCV-3僅在皮炎腎病綜合征的母豬、流產胎兒及公豬精液中檢測出來[12]。因此，本研究針對臨床上有類似癥狀發(fā)病死亡的豬只，建立雙重PCV-3和PCV-2 PCR的檢測方法，為臨床上同時診斷、流行病學調查這兩種病原提供一種切實可行的技術手段。目前，尚未有同時檢測PCV-3和PCV-2 PCR的檢測方法，僅有高通量測序和單一病原的檢測手段[7-8]。隨后我國學者Shen和Ku也在中國的豬群中發(fā)現(xiàn)了該亞型病毒的存在，并建立了PCV-3的PCR檢測方法，最低檢測核酸含量為20.5 pg，且與其他豬源病毒無交叉反應。傳統(tǒng)的診斷病毒的方法有間接ELISA、免疫組織化學、病毒分離等[13,14-17]，前者需要制備特異性抗體，后者需要尋找易感細胞和合適的培養(yǎng)條件，試驗周期均較長，不適合新發(fā)病原的監(jiān)控。而所建立的雙重PCR檢測方法，可以一次反應檢測出PCV-3和PCV-2兩種病毒，最低檢測量為103拷貝/μL，特異性高，可快速、簡便對臨床樣品進行檢測及流行病學調查。

利用建立PCV-3和PCV-2雙重PCR的檢測方法對實驗室收集的256份樣品，PCV-3和PCV-2單獨感染率各為86.3%和0.39%，混合感染率為0.39%。Ku等[12]報道的通過普通PCR從遼寧、重慶3個豬場中的222份樣品中發(fā)現(xiàn)，PCV-3和PCV-2單獨感染率各為62.2%和34.7%，混合感染率為15.8%，和本研究的PCV-3的檢出率相差較大，可能是因為采樣地區(qū)的局限性。對于PCV-3和PCV-2的感染情況，追溯PCV-3來源和各毒株之間的關系，以及對該病毒的分離、致病性研究，仍是目前急需開展的工作，這也有助于防控PCV-3和PCV-2對豬群造成的危害。

[1] Dulac G C,Afshar A.Porcine circovirus antigens in PK 15 cell lines(ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in canadian pigs[J].Can J Vet Res,1989,53(4):431-433.

[2] Opriessnig T,Meng X J,Halbur P G.Porcine circovirus type 2 associated disease:update on current terminology,clinical manifestations,pathogenesis,diagnosis,and intervention strategies[J]. J Vet Diagn Invest,2007,19(6):591-615.

[3] Nielsen G B,Nielsen J P,Haugegaard J，et al.Effect of vaccination against sub-clinical Porcine Circovirus type 2 infection in a high-health finishing pig herd:A randomised clinical field trial[J].Prev Vet Med,2017,141:14-21.

[4] Jiang C G,Wang G,Tu Y B，et al.Genetic analysis of porcine circovirus type 2 in China[J].Arch Virol,2017：1-12.

[5] Karuppannan A K,Opriessnig T.Porcine circovirus type 2(PCV2) vaccines in the context of current molecular epidemiology[J].Viruses,2017,9(5)：99.

[6] 張帆帆,宋德平,周信榮，等.新現(xiàn)豬Delta冠狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及其應用[J].中國農業(yè)科學,2016,49(7):1408-1416.

Zhang F F,Song D P,Zhou X R,rt al.Establishment and application of a RT-PCR assay for detection of newly emerged porcine deltacoronavirus[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(7):1408-1416.

[7] Palinski R,Pineyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirusdistantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J].J Virol,2017,91(1):1879-1891.

[8] Phan T G,Giannitti F,Rossow S，et al.Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multisystemic inflammation[J].Virol J,2016,13(1):184.

[9] Kwon T,Yoo S J,Park C K，et al.Prevalence of novel porcine circovirus 3 in Korean pig populations[J].Veterinary Microbiology,2017,207:178-180.

[10] Fan S,Ku X,Chen F,et al.Complete genome sequence of a novel porcine circovirus type 3 strain,PCV3/CN/Hubei-618/2016,isolated from China[J].Genome Announc,2017,5(15):.e00100-17.

[11] Shen H,Liu X,Zhang P,et al.Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transbound Emerg Dis,2017,5(15):1-3.

[12] Ku X,Chen F,Li P,et al.Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China[J].Transbound Emerg Dis,2017,64(3):703-708.

[13] 劉遠佳,余偉權,李剛,等.新型圓環(huán)病毒—PCV3研究進展及展望[J].豬業(yè)科學,2017,34(5):105-106.

Liu Y J,Yu W Q,Li G,et al.Research advances and prospect of a novel circovirus-PCV3(2017)[J].Swine Industry Science,2017,34(5):105-106.

[14] Phan T G,Giannitti F,Rossow S,et al.Erratum to:Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multi-systemic inflammation[J].Virol J,2016,13(1):184.

[15] 張帆帆,宋德平,郭楠楠,等.以原核表達的豬δ冠狀病毒N蛋白為包被抗原的間接ELISA方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(10):795-799.

Zhang F F,Song D P,Guo N N.et al.Establishment of a recombinant nucleoprotein-based ELISA for detection of antibodies against newly emerged[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Porcine Deltacoronavirus,2016,38(10):795-799.

[16] Hu H,Jung K,Vlasova A N,et al.Isolation and characterization of porcine deltacoronavirus from pigs with diarrhea in the United States[J].J Clin Microbiol,2015,53(5):1537-1548.

[17] Ma Y,Zhang Y,Liang X,et al.Origin,evolution,and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States[J].Mbio,2015,6(2):e00064-15.