苦蕎對高脂膳食誘導(dǎo)小鼠血脂代謝及組織氧化還原的影響

周小理，王 越，趙 燊，周一鳴*，王 宏，侍榮華，肖 瀛

蕎麥為蕎麥屬，我國蕎麥主要分為甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎（F. tataricum L. Gaertn.）2 個栽培品種。蕎麥具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為21世紀(jì)有最前途的最風(fēng)行的綠色食品，國外將之視為“高級營養(yǎng)保健品”[1]。隨著人類的飲食結(jié)構(gòu)逐漸向純天然型和保健型發(fā)展，有著“藥食兼用”美譽(yù)的蕎麥及其系列食品，越來越受到人們的青睞，大力開發(fā)和研制蕎麥保健食品有著廣闊的市場前景、較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值，其相關(guān)系列產(chǎn)品在國際和國內(nèi)的市場上需求很大。

苦蕎作為我國特有的蕎麥品種，其營養(yǎng)成分比甜蕎高出很多，特別是生物類黃酮的含量是甜蕎的13.5 倍，且存在于苦蕎的各個部位[2]。研究表明苦蕎黃酮具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗菌抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等作用，其具有高抗氧化能力，比化學(xué)合成的抗氧化劑如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丁基羥基茴香醚等更安全[3]。同時，苦蕎蛋白（buckwheat protein，BWP）也是苦蕎主要的生物活性成分，約占苦蕎籽粒的15%～17%，主要組成為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白和谷蛋白含量較低，而清蛋白和球蛋白含量較高[4-6]。在功能研究上，苦蕎蛋白提取物具有降低總膽固醇（total cholesterol，TC）濃度，抑制體內(nèi)脂肪積累，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC），促進(jìn)排泄等功效[7-8]，具有比大豆蛋白更好的調(diào)節(jié)血脂效果[9-10]?？嗍w淀粉（buckwheat starch ぼour，BSF）作為苦蕎中最主要的營養(yǎng)成分，含量在60%～70%，尤其是其中的抗性淀粉，具有降低血液TC和甘油三酯（triglycerides，TG）濃度[11-14]的功效，從而可有效降低血脂、預(yù)防脂肪肝的形成[15-17]。此外，苦蕎中還含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)素，其營養(yǎng)成分種類和含量都是其他谷物所無法比擬的[18-20]。

目前對于苦蕎營養(yǎng)成分的研究主要集中在對其營養(yǎng)成分的提取、鑒定[21-24]以及對其抗氧化[25-27]、降血糖[28-29]等功能的研究，而對于苦蕎中主要營養(yǎng)成分調(diào)節(jié)血脂代謝及組織氧化還原能力方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究通過建立動物（C57BL/6小鼠）高脂模型，分析小鼠血漿的TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹血糖（fasting blood-glucose，GLU）、胰島素（insulin，INS）濃度等血脂指標(biāo)以及肝臟勻漿液的抗氧化能力，包括SOD活性、T-AOC水平、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、CAT活性，研究苦蕎主要營養(yǎng)成分（蛋白質(zhì)、淀粉、黃酮類化合物）攝入后對血脂代謝及組織氧化還原性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡雄性實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠，SPF級，體質(zhì)量14～16 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0005（上海，中國）。

苦蕎籽粒（黑豐一號） 山西省左云縣；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇等（均為分析純） 國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；黃酮（標(biāo)準(zhǔn)品） 上海寶曼生物科技有限公司；TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、小鼠胰島素測定試劑盒、T-AOC測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒等 南京建成生物工程研究所；小鼠飼料為自制。

1.2 儀器與設(shè)備

2800型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；血糖測定儀 強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冷凍離心機(jī)美國Sigma公司；Delta320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KK26E28TI超低溫電冰箱 德國西門子有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海森地科學(xué)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎主要營養(yǎng)成分的制備

苦蕎中主要營養(yǎng)成分的制備流程見圖1，獲得苦蕎黃酮（ぼavone，F(xiàn)la）提取物、苦蕎蛋白、苦蕎淀粉。

圖1 苦蕎中主要營養(yǎng)成分的制備流程Fig. 1 Flowchart of preparation of major nutritional components of tartary buckwheat

1.3.2 分組及飼養(yǎng)

45 只4 周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠，以AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料預(yù)飼1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，每組9 只：空白對照組（CK，喂食AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料）；高脂組（HF，喂食含有10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）脂肪、1%膽固醇和0.5%膽酸鈉的飼料）；苦蕎淀粉高脂干預(yù)組（HF＋BSF，即在高脂組飼料的基礎(chǔ)上用苦蕎淀粉替代α-玉米淀粉，且淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%）；苦蕎蛋白高脂干預(yù)組（HF＋BWP，即在高脂組飼料的基礎(chǔ)上用苦蕎蛋白替代酪蛋白，且蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為20%）；苦蕎黃酮高脂干預(yù)組（HF＋Fla，即在高脂組飼料的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的苦蕎黃酮）。將小鼠同室且分籠飼養(yǎng)，進(jìn)行自然光照，并自由飲食和飲水，將環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為60%。

1.3.3 標(biāo)本采集及處理

飼養(yǎng)6 周后稱質(zhì)量，用乙醚將小鼠麻醉后眼球取血，血液立即放入預(yù)先用肝素鈉處理的離心管內(nèi)，4 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清血漿，并保存在-80 ℃的冰箱中待測。隨后立即解剖，迅速取出小鼠的肝臟并稱質(zhì)量，同時稱取小鼠肝臟約200 mg，加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），并在冰浴條件下制備成10%的組織勻漿液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，并保存在-80 ℃的冰箱中待測。

1.3.4 小鼠生長指標(biāo)的測定

分別按照式（1）、（2）、（3）計(jì)算體質(zhì)量增長率、肝臟系數(shù)和腹脂率。

1.3.5 小鼠口服葡萄糖耐受測定

采用血糖測定儀測定禁食12 h（空腹）時GLU濃度/（mmol/L）及灌胃（20%D-葡萄糖溶液的灌胃劑量為2 g/kg體質(zhì)量）0、30、60、120 min時的血糖濃度B/（mmol/L），并以時間為橫坐標(biāo)，各時點(diǎn)血糖值為縱坐標(biāo)，繪制血糖應(yīng)答曲線，分別按照公式（4）、（5）計(jì)算各組灌胃120 min內(nèi)血糖曲線下面積（area under curve，AUC）[30]及血糖生成指數(shù)（glycemic index，GI）[31]。

1.3.6 小鼠血脂生化指標(biāo)的測定

采用試劑盒法測定血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C、GLU和INS的濃度，具體操作方法根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行。分別按照公式（6）、（7）計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）、動脈粥樣硬化指數(shù)（arteriosclerosis index，AI）。

1.3.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量、T-AOC水平、CAT和SOD活力的測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠體質(zhì)量增長率及臟器指數(shù)的影響

表1 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠肝臟指數(shù)及腹脂率的影響（n＝ 9）Table 1 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on liver index and abdominal fat percentage in mice (n= 9)

由表1可知，HF組的小鼠體質(zhì)量增長率最大，達(dá)到了11.53%，HF＋Fla組和HF＋BWP組次之，HF＋BSF組體質(zhì)量增長率最小（7.18%），且均低于空白對照組，表明苦蕎中淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物均能較好抑制肥胖。同時，HF組的肝臟指數(shù)達(dá)到5.90%，顯著高于HF＋BWP組和HF＋BSF組（P＜0.05），表明高脂膳食能使肝臟質(zhì)量增加，而苦蕎淀粉和蛋白質(zhì)能夠顯著降低高脂膳食所引發(fā)的肝臟腫大。并且，高脂膳食誘導(dǎo)后小鼠腹脂率較空白對照組有所提高，而HF＋BSF組和HF＋BWP組腹脂率均有顯著降低（P＜0.05），且均能完全恢復(fù)至空白對照組的水平。

2.2 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠血脂生化指標(biāo)的影響

由表2可知，HF組血漿中的TC、TG濃度最高，且均顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明小鼠高脂模型建模成功。同時，HF＋BSF組和HF＋BWP組血漿中的TC、TG濃度較HF組均有顯著降低，并且，高脂膳食誘導(dǎo)后小鼠血漿中HDL-C濃度較空白組顯著降低，LDL-C濃度顯著升高，而喂食含有苦蕎淀粉、苦蕎蛋白的飼料后HDL-C濃度較HF組均有顯著升高（P＜0.05），LDL-C濃度有顯著降低（P＜0.05），并且較好地恢復(fù)至空白對照組水平。此外，AI值結(jié)果表明，高脂膳食可使其升高，從而使動脈粥樣硬化發(fā)病率提高，而喂食了含有HF＋BSF的飼料后，AI值能基本恢復(fù)至空白組的水平，表明苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠動脈粥樣硬化具有一定的修復(fù)作用。

表2 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on blood lipid levels in mice

2.3 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠血糖指標(biāo)的影響

表3 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠血糖濃度的影響Table 3 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on blood glucose index in mice

由表3可知，各實(shí)驗(yàn)組均在灌胃30 min后達(dá)到血糖濃度峰值，灌胃60 min和120 min血糖有下降趨勢，其中，HF組小鼠灌胃120 min后血糖濃度高于HF＋BWP組、HF＋BSF組和HF＋Fla組，其中，HF＋BSF組與HF組有顯著性差異（P＜0.05）。

由表4可知，HF組小鼠GLU濃度最高，HF＋Fla組和HF＋BWP組次之，HF＋BSF組最低。HF＋BWP組和HF＋BSF組與HF組有顯著差異（P＜0.05）。同時，HF組AUG最大，高于其他實(shí)驗(yàn)組，其中，其中HF＋BWP組和HF＋BSF組較HF組差異顯著（P＜0.05），表明高脂膳食誘導(dǎo)引起小鼠糖耐量受損，而苦蕎中淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物均能改善高脂膳食引起的糖耐量受損。

此外，由表4還可以看出，HF組較空白對照組，血漿中INS濃度顯著增加（P＜0.05），而ISI值最小，說明HF組單位胰島素的效果最差，分解糖類的程度最低。而HF＋BSF組、HF＋BWP組和HF＋Fla組與HS組相比INS濃度增幅較小，ISI值升高，說明苦蕎中淀粉、蛋白質(zhì)均能顯著抑制高脂膳食所引起的胰島素含量增加，同時，HF＋BSF組和HF＋BWP組可顯著提高ISI值（P＜0.05），并且基本恢復(fù)到空白對照組的水平，而HF＋Fla組ISI值也高于HF組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠肝臟組織勻漿抗氧化指標(biāo)的影響

表5 苦蕎主要營養(yǎng)成分對小鼠臟器抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of major nutritional components of tartary buckwheat on antioxidant indexes in mouse liver

由表5可知，高脂膳食可導(dǎo)致肝臟勻漿液中的SOD活力降低，其中HF組降幅顯著（P＜0.05），而HF＋BSF組、HF＋BWP組和HF＋Fla組與HF組相比差異顯著（P＜0.05）。T-AOC水平可以全面反映機(jī)體整體的抗氧化水平，高脂膳食誘導(dǎo)可引起小鼠肝臟的T-AOC下降，而各實(shí)驗(yàn)組的T-AOC均有所上升，其中HF＋BSF組最高；MDA是機(jī)體內(nèi)環(huán)境脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終極代謝產(chǎn)物，該值的大小可以代表機(jī)體的脂質(zhì)過氧化水平，在一定條件下間接揭示了細(xì)胞被破壞程度。高脂膳食誘導(dǎo)可引起小鼠肝臟的MDA含量顯著上升（P＜0.05），而各實(shí)驗(yàn)組均可顯著抑制高脂飲食引起的脂質(zhì)過氧化（P＜0.05）；CAT活力反映的是整個機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，高脂膳食可顯著降低CAT的活力（P＜0.05），說明其抗氧化能力較弱，而喂養(yǎng)不同的飼料后，CAT活力顯著升高（P＜0.05），且HF＋BSF組的效果最佳。綜上所述，苦蕎淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物均能較好地保護(hù)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，且均能恢復(fù)至空白對照組的水平。

2.5 生理生化指標(biāo)與肝臟抗氧化性的相關(guān)性分析

表6 生理生化指標(biāo)與肝臟抗氧化性的相關(guān)性分析（n＝9）Table 6 Correlation analysis between physio-biochemical indexes and antioxidant activity in liver (n= 9)

從表6可以看出，T-AOC、CAT活力、SOD活力與HDL-C濃度、ISI值呈正相關(guān)，與其他指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，其中T-AOC和SOD活力與AI值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低；MDA含量與HDL-C濃度、ISI值呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)程度較高，與其余指標(biāo)均呈正相關(guān)，且與LDL-C濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明LDL-C濃度越高，肝臟的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量越高，其中MDA與AI值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明AI值越高，肝臟的抗氧化能力越低，脂質(zhì)過氧化越嚴(yán)重。

3 討 論

隨著生活水平的提高，現(xiàn)代社會人們的飲食結(jié)構(gòu)從低脂高膳食纖維飲食向高脂高糖飲食轉(zhuǎn)變，而高脂高糖飲食是血液生化指標(biāo)發(fā)生紊亂的誘因。血液生化指標(biāo)紊亂會引起心腦血管疾病，影響人類的身體健康，如2型糖尿病的重要特征就是血脂血糖水平不正常。本研究在建立小鼠高脂模型基礎(chǔ)上，通過對小鼠主要生長指標(biāo)、血液生理生化指標(biāo)以及肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定，研究了苦蕎主要營養(yǎng)成分（蛋白質(zhì)、淀粉、黃酮類化合物）攝入后對血脂代謝及組織氧化還原性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：高脂膳食能夠引起體質(zhì)量增加和GLU濃度的顯著升高，降低胰島素效果，從而在誘發(fā)小鼠產(chǎn)生肥胖的同時，有并發(fā)糖尿病的趨勢；而在高脂膳食中添加苦蕎淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物可降低高脂膳食所帶來的體質(zhì)量增加，而且可以有效降低小鼠GLU濃度，改善高脂飲食引起的糖耐量受損，提高ISI值。同時，高脂飲食顯著升高小鼠血漿中TC、TG、LDL-C濃度和AI值，并且使HDL-C濃度降低，而苦蕎（淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物）可顯著降低高脂膳食引起的血漿中TC、TG濃度以及LDL-C濃度的上升，同時有效降低高脂膳食所引起的AI值升高，降低動脈粥樣硬化發(fā)病率。此外，苦蕎（淀粉、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物）對機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)具有較好的保護(hù)和修復(fù)與作用，可以提高組織中T-AOC水平、顯著提高CAT和SOD活力，抑制MDA的產(chǎn)生。最后，生理生化指標(biāo)與肝臟抗氧化性的相關(guān)性分析表明：T-AOC、CAT和SOD活力與HDL-C濃度、ISI值呈正相關(guān)，與其他指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，其中T-AOC和SOD活力、AI值呈顯著負(fù)相關(guān)，說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低；MDA含量與HDL-C濃度、ISI值呈負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)均呈正相關(guān)，其中MDA含量與AI值呈顯著正相關(guān)，說明AI值越高，肝臟的抗氧化性越低，脂質(zhì)過氧化越嚴(yán)重。

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