李 竹 許莉萍 蘇亞春 吳期濱 成 偉 孫婷婷 高世武

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 福建福州 350002

甘蔗(Saccharum spp.)是最主要的糖料作物, 2015年超過 110個國家種植甘蔗達 2380萬公頃, 蔗莖產(chǎn)量為177 000萬噸[1]。甘蔗褐銹病因其產(chǎn)孢量大、流行性強并導(dǎo)致產(chǎn)量和蔗糖分的嚴重損失而成為甘蔗生產(chǎn)上最主要的病害之一, 該病由黑頂柄銹菌(Puccina melanocephala H. Sydow & P. Sydow)擔(dān)孢子侵入氣孔所致, 已遍布世界各甘蔗產(chǎn)區(qū)[2-4]。銹病還導(dǎo)致主栽品種的淘汰, 如 1980s以來, 美國、印度等甘蔗主產(chǎn)國的主栽品種CP78-1247、Co745、CL41-23等因感染褐銹病而被取消商業(yè)化種植[5-6],我國蔗區(qū)生產(chǎn)性品種如桂糖 15、臺糖 86-1626、桂糖 17等已不再種植的主要原因也是感褐銹病[7]。甘蔗育種概率極低且周期長, 一般認為從實生苗育成品種的概率約為1/100 000～300 000, 耗時8～10年。目前, 我國甘蔗年生產(chǎn)雜交組合超過3000個, 年種植實生苗60～80萬株, 一般每公頃種植3.00～3.75萬株, 一般在種植后第2年對宿根蔗進行選擇?？梢? 甘蔗雜交育種人力物力投入巨大, 但對某一主要流行性病害的抗性不足, 足以導(dǎo)致其難以大面積推廣應(yīng)用。近幾年新釋放的高糖高產(chǎn)甘蔗品種粵糖 60因高感褐銹病, 推廣面積因之下降; 而近 2年新審(鑒)定的品種福農(nóng)41、桂糖46等以及目前正在進行國家區(qū)域試驗的云蔗 09-1601等, 都表現(xiàn)出了高感褐銹病。因此, 需要從源頭, 也即親本選擇與組合配制上加強針對性研究,而惟有了解抗病性遺傳和親本的抗病性, 才能有預(yù)見性地配制雜交組合, 有效提高分離群體創(chuàng)制中抗病個體的幾率。此外, 抗病育種另一必不可少的環(huán)節(jié)就是建立并應(yīng)用經(jīng)濟有效的技術(shù)手段與方法, 實現(xiàn)對褐銹病抗性的鑒定。

由于甘蔗復(fù)雜的遺傳背景——異源多倍體特性, 現(xiàn)代甘蔗栽培種的基因組尚未被測序, 導(dǎo)致具有實際應(yīng)用價值的標(biāo)記開發(fā)困難, 迄今只有基于抗褐銹病的主效基因Bru1所開發(fā)的2個標(biāo)記具有實用性。該標(biāo)記是 1996年法國科學(xué)家Daugrois等[8]利用R570自交后代所構(gòu)建的遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)的, 距離為10 cM。而后, 該團隊的Asnaghi等[9]在自交后代田間抗褐銹病性鑒定基礎(chǔ)上, 利用集群分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)結(jié)合AFLP (amplified fragment length polymorphism)標(biāo)記技術(shù), 在10 cM區(qū)間內(nèi), 獲得了440個標(biāo)記, 其中位于Bru1基因兩側(cè)的2個標(biāo)記距離最近(1.9 cM和2.2 cM)。最后D’Hont團隊通過高粱、水稻比較作圖和染色體步移方法, 最終定位了與Bru1基因緊密連鎖的標(biāo)記R12H16和9020-F4, 距離該基因為0.28 cM和0.14 cM[10]。此后, 這2個標(biāo)記被廣泛用于評價甘蔗種質(zhì)資源、品種和育種材料的抗病性[11-12,14-16]。但是,研究也發(fā)現(xiàn)表型抗病但標(biāo)記檢測呈陰性的現(xiàn)象[14,16], 提示了可能存在其他的抗病基因。此外, 由于當(dāng)時還無條件進行抗病基因檢測, 目前雖已有多篇有關(guān)甘蔗褐銹病抗性遺傳的報道[17-20], 但都是基于田間表型發(fā)病情況的分析,且不同的研究所獲得的結(jié)論并不一致。Tai等[17]認為甘蔗雜交后代的褐銹病抗性分離屬于偏感病性分離, 且抗性遺傳效應(yīng)是由基因的非加性效應(yīng)所決定的。但王建南等[19]的研究則認為甘蔗雜交后代的褐銹病抗性分離屬于偏抗病性分離, 甘蔗對銹病的抗性遺傳主要是由基因的加性效應(yīng)所控制[18]。國內(nèi)前人的研究[19-20]所用的試驗基地是在非甘蔗主產(chǎn)區(qū)的福建省福州市, 發(fā)病條件并不充分, 這從研究報告[19]中雜交后代6級(感病)及以上的個體很少也說明了這一點, 因此, 非常有必要在適宜甘蔗褐銹病流行的主產(chǎn)蔗區(qū)試驗, 并把田間表型調(diào)查與抗病基因的分子標(biāo)記檢測相結(jié)合, 來探討抗病性遺傳。

本研究以4個甘蔗雜交組合分離群體為材料, 在適宜褐銹病發(fā)生和流行的甘蔗主產(chǎn)區(qū), 于自然誘發(fā)條件下進行抗病性表型鑒定, 并采集葉片進行 Bru1基因檢測, 以期了解甘蔗褐銹病抗性遺傳情況, 并為抗褐銹病育種提供新抗原以及挖掘抗病新基因和開發(fā)新標(biāo)記的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用 4個甘蔗(Saccharum spp. hybrid)雜交組合ROC25×柳城 03-1137、ROC25×粵糖 84-3、CP94-1100×ROC25、CP84-1198×云蔗89-7的分離群體的實生苗材料, 以栽培面積最大的主栽品種 ROC22為抗病對照,高感品種粵糖60為感病對照。將其種植在我國甘蔗銹病發(fā)生與流行最嚴重的蔗區(qū)云南省德宏傣族景頗族自治州隴川縣。Bru1基因檢測所用陰性對照為不含 Bru1基因且高感甘蔗褐銹病的甘蔗品種粵糖 60, 陽性對照為含Bru1基因且抗褐銹病的甘蔗品種R570, 后者也是甘蔗界Bru1基因檢測通用的模式種。

1.2 田間發(fā)病率調(diào)查

2015年6月, 將上述4個雜交組合的實生苗定植在田間, 行距 1.1 m, 株距 0.4 m, 連續(xù)種植, 每個組合兩行,每行70～75株, 常規(guī)管理。在新植季褐銹病流行期間, 先后2次調(diào)查發(fā)病情況。第1次在病害流行盛期(2015年9月 2日), 先調(diào)查該組合總株數(shù)和病株數(shù), 以便獲得該組合F1分離群體的發(fā)病率, 再調(diào)查15株感病植株及15株無病害癥狀的植株, 要求病斑面積占葉片總面積 35%以上,均一一標(biāo)記, 以備后續(xù)對應(yīng)調(diào)查, 并采集病株和健株無病害癥狀的–1葉片, 用于檢測Bru1基因; 第2次在病害流行末期(2016年1月20日), 對第1次調(diào)查并標(biāo)記的每組合各 30株的甘蔗植株病害發(fā)生情況逐一記錄。判斷第 1次調(diào)查正處于發(fā)病盛期且褐銹病的發(fā)病條件是充分的依據(jù)是, 作為抗病對照的主栽品種 ROC22未感病, 未發(fā)現(xiàn)帶有病害癥狀的植株; 作為感病對照的甘蔗品種粵糖 60,其+2和+3葉有極多孢子堆, 病斑占葉片總面積50%以上。在參考前人[13]基于葉片侵染狀況定性描述與劃分的基礎(chǔ)上, 結(jié)合李文鳳等[14]的定量描述確定甘蔗對褐銹病抗、感類型與分級標(biāo)準(zhǔn), 詳見表1。

1.3 Bru1基因的分子檢測

參照 Costet等[21]的方法, 設(shè)計檢測甘蔗抗褐銹病Bru1基因標(biāo)記R12H16和9O20-F4的PCR引物, 委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中, R12H16標(biāo)記的擴增產(chǎn)物長度為570 bp, 其下游引物為5′-CTTATG TTAGCGTGACCTATGGTC-3′, 上游引物為 5′-CTACGAT GAAACTACACCCTTGTC-3′; 9O20-F4標(biāo)記的擴增產(chǎn)物長度為200 bp, 上游引物為5′-TACATAATTTTAGTGGCACT CAGC-3′, 下游引物為 5′-ACCATAATTCAATTCTGCAGG TAC-3′。利用CTAB法[22], 提取供試甘蔗材料的葉片基因組DNA, 包括 120份分離群體的個體、配制 4個雜交組合的6個雜交親本和抗、感對照種各1個。利用紫外分光光度計(NanoVue plus, GE, USA)測定樣品濃度和純度,–20°C冰箱保存?zhèn)溆谩⒄涨叭薣23]的 PCR體系和各組分含量以及反應(yīng)程序進行 PCR擴增, 其中 R12H16標(biāo)記的PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測, 9O20-F4標(biāo)記的PCR產(chǎn)物采用Rsa I的酶解產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測進行判別。

表1 甘蔗褐銹病抗病性鑒定評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Identification standard of sugarcane resistance to brown rust disease

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代群體褐銹病田間表型鑒定情況

不同組合分離群體的褐銹病發(fā)病率為13.0%～54.3%。高感父本粵糖84-3與高抗母本所配制的雜交分離群體的褐銹病發(fā)生率仍高達 54.3%, 相對而言, 感病性稍低的感病父本柳城 03-1137與同為高抗的母本所獲得的雜交后代發(fā)病率下降(39.0%), 尤其值得強調(diào)的是, 高抗母本CP84-1198與高抗父本云蔗 89-7的雜交后代發(fā)病率低,僅13.0% (表2)。說明母本和父本的抗病性均影響雜交后代的抗病性, 但父系成分對雜交后代的抗病性影響更大。

2.2 抗褐銹病基因Bru1分子標(biāo)記的穩(wěn)定性分析

為了進一步利用抗病主效基因Bru1的分子標(biāo)記來驗證親本和雜交后代的抗、感病性, 以抗病模式對照種R570和高感對照種粵糖60為模板進行Bru1基因檢測的技術(shù)體系穩(wěn)定性驗證。結(jié)果顯示, 抗病對照能穩(wěn)定擴增出Bru1基因特異標(biāo)記之一的R12H16的特征帶, 長度為570 bp, 同時, 還擴增出該基因的另一特異標(biāo)記 9O20-F4, 其PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切顯示特征帶長度為200 bp, 上述2個特異標(biāo)記的特征帶大小與預(yù)期片段大小一致, 而感病對照種粵糖60和空白對照均未擴增出特異性的條帶(圖1), 表明在本實驗的檢測系統(tǒng)中, Bru1基因能被2個特異性標(biāo)記R12H16和9O20-F4有效檢出。

2.3 F1代分離個體褐銹病田間表型的穩(wěn)定性和 Bru1基因檢測

4個雜交組合F1代分離群體的田間發(fā)病率與Bru1基因檢出率如表3所示。各組合在褐銹病發(fā)生盛期所調(diào)查的15 (共60)株病株中, 發(fā)病末期有57株表現(xiàn)病害癥狀; 而發(fā)病盛期所調(diào)查的15株(共60株)健株中, 有50株仍無病害癥狀。R12H16和9O20-F4標(biāo)記檢測結(jié)果顯示, 發(fā)病盛期60份感病材料中, 58份未檢測到Bru1基因, 占供試材料的 96.7%, 其余 2份(組合 ROC25×粵糖 84-3的 4、12號植株)檢測到Bru1基因, 目標(biāo)片段的檢測電泳圖如圖2。為了進一步確認組合 ROC25×粵糖 84-3編號為4、12號的感病植株所檢測到的片段是否能支撐檢測到Bru1基因,我們將分子標(biāo)記R12H16和9O20-F4檢測出的片段進行克隆、測序, 并與陽性對照樣品所獲得的 Bru1基因序列比對, 發(fā)現(xiàn)序列具有一致性, 不存在堿基差異。說明利用基于Bru1基因所開發(fā)的2個分子標(biāo)記R12H16和9O20-F4,在檢測表型為感病的植株時, 個別也能呈陽性。此外, 兩次調(diào)查均未發(fā)病的50份材料中, 33份檢測到Bru1基因,占供試材料的66.0%; 17份未檢測到Bru1基因, 占供試材料的 34.0%, 未檢測到 Bru1基因的材料分布在組合CP94-1100 × ROC25 和 CP84-1198×云蔗 89-7。說明CP84-1198和云蔗89-7的抗病性是由不同于Bru1基因的抗病基因所控制。

表2 甘蔗雜交親本及其分離群體的褐銹病抗性、Bru1基因及發(fā)病率鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of brown rust resistance, Bru1 gene and incidence rate in sugarcane crossing parents and their segregation population

圖1 基于特異標(biāo)記R12H16 (A)和9O20-F4 (B)檢測甘蔗褐銹病抗病和感病對照種中的Bru1基因Fig. 1 Detection of Bru1 gene in sugarcane brown rust resistant and susceptible control varieties based on the markers of R12H16 (A)and 9O20-F4 (B)

3 討論

前人[24]在證明甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1對不同來源的褐銹病分離物具有廣譜抗性的基礎(chǔ)上, 經(jīng)過一系列研究[9,25], 最后由Costet等[10]針對該基因, 開發(fā)出了與其密切關(guān)聯(lián)的兩個分子標(biāo)記R12H16和9O20-F4, 被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于不同國家所保育的甘蔗種質(zhì)資源、品種和候選品系的檢測[26-28], 為抗病種質(zhì)的利用提供了科學(xué)依據(jù)。但在研究中也發(fā)現(xiàn)了表型抗病卻未檢出 Bru1基因[14,16,26]或表型感病卻檢出 Bru1基因[12]的情況。本研究組合之一ROC25×粵糖84-3中出現(xiàn)了2份檢測出Bru1基因的感病材料, Glynn等[11]的研究也有類似發(fā)現(xiàn), 推測極有可能因為黑頂柄銹菌發(fā)生小種進化使得抗性基因Bru1失效。我們采用雜交分離群體為材料的研究, 也發(fā)現(xiàn)表型抗病卻未檢出 Bru1基因的情況, 盡管不同雜交組合后代出現(xiàn)這種未檢出Bru1基因的概率不同, 如組合CP84-1198×云蔗89-7的概率達到100%, 以CP94-1100為親本的雜交后代也有小概率發(fā)生, 僅有2個組合ROC25×柳城03-1137和ROC25×粵糖84-3未發(fā)現(xiàn)表型抗病但未檢出Bru1基因的情況。說明甘蔗基因池中不僅有主效基因Bru1所決定的褐銹病抗性, 還有未知的主效基因所決定的抗性。在所測試的親本中, CP84-1198和云蔗89-7的抗病性是由不同于Bru1基因的新抗褐銹病基因所控制。因此, 就挖掘新的抗褐銹病基因而言, 高抗親本 CP84-1198和云蔗 89-7值得特別關(guān)注。

圖2 用R12H16和9O20-F4標(biāo)記檢測組合ROC25 × Yuetang 84-3感病植株中的Bru1基因Fig. 2 Detection of resistance gene Bru1 with R12H16 and 9O20-F4 markers in susceptible plants of hybrid combination ROC25×Yuetang 84-3

表3 4個雜交組合分離群體的田間抗性表現(xiàn)與Bru1基因檢出情況Table 3 Brown rust resistance and detection of Bru1 in segregation population derived from four sugarcane hybrid combinations

考慮到我們在田間試驗中未針對褐銹病的病原菌深入研究, 因此, 是否存在Glynn等[11]所推測的病原菌小種變異不得而知, 但是, 我們的研究獲得了在陰性對照未檢出條帶的情況下, 2份檢測出Bru1基因的感病材料與同組合抗病材料和陽性對照材料的 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果一致,同時, 所研究的 4個雜交組合中有一個組合(CP84-1198×云蔗89-7)無論抗、感個體, 均未檢測出Bru1基因的存在。鑒于甘蔗對褐銹病抗性屬于質(zhì)量性狀, 因此, 我們的研究更傾向于認為這2個感病株系可能存在Bru1基因的某一區(qū)段發(fā)生變異或某些位點發(fā)生突變而導(dǎo)致該基因失效,而組合CP84-1198×云蔗89-7中則更大可能是存在不同于Bru1基因的新基因。相關(guān)的其他前人研究中, 也有報道表型抗病的材料中標(biāo)記陽性率低的情況。如Parco等[12]在對美國路州部分甘蔗品種和候選品系的研究中, 發(fā)現(xiàn)其Bru1基因的標(biāo)記陽性率僅占 4.3%, 并存在標(biāo)記檢測陽性但表型感褐銹病的基因型如 L10-146, 或標(biāo)記檢測陰性但品種抗褐銹病如L99-233等。此外, 在有的研究中, 表型鑒定為抗病但未檢測到與Bru1基因連鎖的2個標(biāo)記的材料占了相當(dāng)大的比例, 如Racedo等[16]報道了在49個表型抗病的甘蔗基因型中, 只有8個(占16.3%)檢測到Bru1基因, 再對 190份所保育的甘蔗種質(zhì)進行檢測, 發(fā)現(xiàn)僅 7%可檢測到Bru1基因。鑒于此, 在甘蔗抗褐銹病育種中, 我們依然可以利用這2個與Bru1基因緊密連鎖的特異性標(biāo)記來選擇抗病的種質(zhì), 因為它提供了一種有效的對褐銹病抗性進行標(biāo)記輔助鑒定的技術(shù)方法, 只要標(biāo)記檢出陽性, 基本可判斷為具有抗褐銹病性。但是, 該標(biāo)記在應(yīng)用于雜交后代分離個體的輔助選擇時, 則要根據(jù)親本的情況而定, 也就是要考慮其雜交親本中是否存在該基因, 如存在Bru1基因, 則可以根據(jù)標(biāo)記R12H16和9020-F4的存在進行判定, 反之則不行。研究結(jié)果還提示后續(xù)研究的線索, 也即針對甘蔗基因池中所存在的異于 Bru1基因的新基因進行鑒定和連鎖標(biāo)記研究的必要性, 目的是為甘蔗抗褐銹病育種提供新的基因資源以及選育具有復(fù)合抗褐銹病基因的品種。

甘蔗雜交后代抗褐銹病性狀的分離情況以及父母本對雜交后代抗病性的影響, 對指導(dǎo)甘蔗抗褐銹病育種具有重要意義, 不僅直接影響親本選擇與組合配制, 還直接關(guān)系到所創(chuàng)制的分離群體中抗病個體的幾率, 從而直接影響抗病育種的成效。目前, 已報道的有關(guān)甘蔗雜交后代對褐銹病抗性的分離情況研究結(jié)論不一致。Tai等[17]利用13個甘蔗雜交組合和2個自交群體, 根據(jù)田間表型抗病和感病表現(xiàn), 認為雜交后代對褐銹病抗性呈偏感病性的偏態(tài)分離, 而國內(nèi)的研究結(jié)論是呈偏抗病性的偏態(tài)分離[19]。分析原因主要是由于國內(nèi)的研究是在非甘蔗產(chǎn)區(qū)進行的,病害脅迫壓力小, 病害發(fā)生與流行的條件也不充分, 這從其所調(diào)查的數(shù)據(jù)中 6～9級的感病個體在分離群體中只占很小比例(2.92%), 就能說明這一點, 這直接導(dǎo)致了該研究得出雜交后代呈偏抗病性的偏態(tài)分離的研究結(jié)論。

在遺傳效應(yīng)研究上, 國內(nèi)研究[20]認為甘蔗對銹病的抗性遺傳主要是由基因的加性效應(yīng)所控制, 母本對后代抗性的影響較大?；谠摻Y(jié)論, 在甘蔗抗褐銹病育種中, 就要特別強調(diào)和重視母本的抗病性。但在 Tai等[17]的研究中, 則認為甘蔗對銹病的抗性遺傳主要是由基因的非加性效應(yīng)所控制。同時, 后續(xù)國外的多篇研究[21,24]卻證明甘蔗對褐銹病的抗性是由主效基因控制的質(zhì)量性狀, 并且鑒定出主效基因 Bru1[8-10], 開發(fā)出與該基因緊密連鎖的特異性標(biāo)記R12H16和9020-F4, 已被國際甘蔗界廣泛應(yīng)用[11-12,15,27,29]。我們基于田間抗、感病性表型與Bru1基因檢測相結(jié)合的研究, 認為甘蔗基因池中存在控制褐銹病抗性的主效基因, 同時, 除已經(jīng)被鑒定出來的Bru1基因外, 還存在目前還未被鑒定的不同于 Bru1的主效基因, 且傾向于父系組分對雜交后代抗病性影響大于母系。分析原因可能是該研究中用于分析的數(shù)據(jù)源來自王建南等[19], 也即存在發(fā)病條件不充分, 從而導(dǎo)致估算的偏差所致。在父系還是母系組分對雜交后代的影響更大的研究上, 我們的研究結(jié)論與Tai等[17]的不一致, 我們所采用的組合數(shù)較少, 存在不足, 但分析數(shù)據(jù)是基于表型和 Bru1基因檢測相結(jié)合, 且田間設(shè)置了高抗(ROC22)和高感(粵糖 60)對照, 并顯示發(fā)病條件充分, 同時, 以高抗親本 ROC25作為母本所配制的2個雜交組合中, 與高感父本(粵糖84-3)配制的雜交后代的發(fā)病率(54.3%)明顯高于與感病父本(柳城 03-1137)配制的雜交后代的發(fā)病率(39.0%), 同時, 以同一高抗親本ROC25作為父本的組合中, 與感病母本(CP94-1100)配制的雜交后代的發(fā)病率明顯下降(28.4%)。Tai等[17]的早期研究所采用的組合數(shù)量更多, 但該研究當(dāng)時無條件進行Bru1基因檢測, 僅根據(jù)田間表型數(shù)據(jù), 同時, 其田間試驗也未見設(shè)置高感或感病對照種, 因此, 無從判斷病害發(fā)生條件是否充分。

致謝: 國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系植保崗位專家云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃應(yīng)昆研究員提供柳城03-1137的褐銹病抗病鑒定結(jié)果, 實驗材料種植在云南省德宏自治州甘蔗科學(xué)研究所基地, 本實驗室周定港、凌輝、劉峰等同學(xué)幫助樣品DNA提取和質(zhì)量檢測, 特此致謝。

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