胡雪芹

（珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司，廣東珠海 513000）

1 材料方法

1.1 分子篩層析原液制備

乙型腦炎病毒感染Vero細胞后收獲的病毒液[1]，用Millipore公司生產(chǎn)濾膜截留分子300 kD，超濾濃縮20倍左右，用β-丙內(nèi)酯1∶4 000滅活，然后經(jīng)過硫酸魚精蛋白沉淀[2]，再經(jīng)過S-300凝膠過濾，收集第一峰得分子篩柱層析原液[3]。

1.2 層析工藝參數(shù)

兩種層析凝膠的參數(shù)見表1。

表1 層析工藝參數(shù)

1.3 檢測指標

蛋白含量、抗原含量、牛血清殘留、vero細胞宿主蛋白及DNA殘留、效力等檢定均按2010版藥典規(guī)定測定[4]。

1.4 疫苗半成品的制備

用20120303、20120304、20120401三批滅活水解液，經(jīng)過硫酸魚精蛋白沉淀，再經(jīng)過凝膠過濾S-300純化收集第一峰獲得柱層析原液。分別經(jīng)過DEAE Sepharose FF和Capto DEAE凝膠純化，純化后病毒經(jīng)除菌過濾得疫苗原液，加入保護劑和鋁佐劑，分別配制成半成品。

2 實驗結(jié)果

2.1 離子交換層析

含有乙型腦炎病毒抗原的分子篩柱層析原液，分別上樣吸附在DEAE Sepharose FF和Capto DEAE離子交換層析柱上，使用含NaCl的緩沖液線性洗脫，在280 nm紫外檢測下，出現(xiàn)三個吸收峰，經(jīng)ELISA法證實第一峰為乙型腦炎病毒抗原峰，第二、三峰為無抗原活性或比活差的雜蛋白峰，如圖1和圖2所示。

圖1 乙型腦炎Capto DEAE離子交換層析圖譜

圖2 乙型腦炎DEAESepharose FF離子交換層析圖譜

2.2 純化圖譜比較

從DEAE Sepharose FF凝膠純化圖譜來看，很難根據(jù)峰形收集目標抗原。Capto DEAE凝膠純化圖譜分離度好，可以根據(jù)峰形可將雜蛋白和目標抗原更好地分離，操作簡單方便。

2.3 離子交換純化前后抗原和雜質(zhì)的檢定數(shù)據(jù)比較

表2至表5為Capto DEAE和DEAE Sepharose FF三批純化后原液的檢測結(jié)果，Capto DEAE純化后原液殘留的牛血清白蛋白蛋白和宿主蛋白都比DEAE Sepharose FF凝膠純化后原液低。從表2DNA殘留純化結(jié)果可以看出，兩種凝膠對Vero細胞DNA的去除相同。從表1抗原EIA比活數(shù)據(jù)，Capto DEAE純化后原液的比活比DEAE Sepharose FF高。Capto DEAE吸附載量高，流速快，工作效率高，并且收集液的抗原回收率高。

表2 抗原純化結(jié)果比較

表3 DNA殘留純化結(jié)果比較

3 結(jié)論

用離子交換凝膠Capto-DEAE替代DEAESepharose純化乙腦病毒抗原是可行性的。從DEAE Sepharose FF凝膠純化圖譜來看，很難根據(jù)峰形收集目標抗原。Capto DEAE凝膠純化圖譜分離度好，可以根據(jù)峰形可將雜蛋白和目標抗原更好地分離，操作簡單方便。

Capto DEAE純化后原液殘留的牛血清白蛋白蛋白和宿主蛋白都比DEAE Sepharose FF凝膠純化后原液低。Capto DEAE純化后原液的比活比DEAE Sepharose FF高。Capto DEAE吸附載量高，流速快，工作效率高，并且收集液的抗原回收率高。不僅產(chǎn)品質(zhì)量更好，而且生產(chǎn)效率也得到了提高。

表4 牛血清白蛋白殘留純化結(jié)果比較

表5 宿主蛋白殘留純化結(jié)果比較

[1]王輝,過琴媛,張月蘭,等.Vero細胞乙型腦炎純化疫苗生產(chǎn)工藝參數(shù)的研究[J].微生物免疫學(xué)進展,2006,34(3):15-17.

[2]韓德勝,李振平,李薇,等.硫酸魚精蛋白去除Vero細胞乙腦疫苗殘余DNA方法的條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2007,35(4):14-18.

[3]魯宏,竇志勇.人用精制Vero細胞狂犬病疫苗純化方法選擇[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2000,28(4):5-7.