新型標本保存液的開發(fā)

葛棟，趙曉青，顧孝連

（上?？萍拣^，上海200127）

長期以來，博物館對浸制標本使用酒精、福爾馬林固定，其中，標本的分子生物學研究利用可使用酒精來保存，而福爾馬林保存的標本可用于形態(tài)解剖學等研究，如組織切片制作的材料都使用福爾馬林來保存。但是，博物館展陳的浸制標本在使用酒精和福爾馬林的過程中存在不少缺點，如酒精具燃燒性，在使用的過程中比較危險；福爾馬林刺激性較大，對研究人員的眼睛和呼吸道都有一定的傷害，長期接觸福爾馬林具有一定致癌性。鑒于此，開發(fā)新型的標本保存液對標本保存和研究人員的健康都具有重要意義。而標本腐敗的原理是細菌和霉菌的作用[1，3]，找出合適的抗菌防霉試劑，是開發(fā)標本保存液的關鍵[4]。

為了配合上海自然博物館（上海科技館分館）標本研究、展示和保存的需要減少對觀眾和工作人員的傷害。本實驗擬通過篩選和復配新型浸制標本保存液，改良當前博物館浸制標本的保存方法，既可以減少酒精和福爾馬林的危害，又可不依賴市面上的其他產(chǎn)品。通過組配和篩選，開發(fā)新型浸制標本保存液，可以大大降低標本制作保存成本，節(jié)約運營經(jīng)費。

1 實驗部分

1.1 初篩實驗步驟

選取市場上常見的25種工業(yè)殺菌劑原料藥進行平板抑菌法實驗[2]，篩選出抑菌殺菌能力較強的藥物10種，其主要過程和方法如下。

（1）用接種環(huán)在火焰旁挑取各試管斜面的菌株于帶玻璃珠的無菌水中，振蕩，制成混合霉菌孢子或細菌懸浮液。測試菌株為8株真菌、5株細菌。

（2）用無菌吸管向各無菌培養(yǎng)皿內(nèi)注入0.5mL的菌懸浮液。

（3）向各培養(yǎng)皿內(nèi)注入15～20mL熔化狀瓊脂培養(yǎng)基(約45℃)，將培養(yǎng)基與菌液混合均勻，待其冷卻。

（4）用鑷子將2 cm直徑圓片濾紙在0.5%濃度的抗菌劑中浸漬片刻，將浸漬過藥劑的濾紙片在容器壁上接觸一下，以去除多余的藥劑，然后置于帶菌培養(yǎng)基平板的中央，蓋上蓋子。

（5）置適宜溫度下［霉菌（28±1）℃，細菌（37±1）℃］培養(yǎng)一定時間（霉菌72 h，細菌24 h）取出，由于圓片濾紙所吸附的抗菌劑慢慢地向四周擴散，因此，在圓片濾紙周圍就會出現(xiàn)清晰的抑菌圈，其抑菌圈的大小便可代表抗菌防霉能力。

1.2 復篩選實驗步驟

不同濃度的藥劑和供試菌液，依次注入滅菌的培養(yǎng)皿中。并依次注入瓊脂培養(yǎng)基，搖勻蓋上蓋子。在適宜溫度下培養(yǎng)，觀察其生長情況，判斷該藥物對此菌種的最低抑制濃度。

用MIC法對各種微生物做最低抑制濃度的檢測實驗[6]，對篩選出的藥物進行復配，篩選出最有效的藥物，其過程和方法如下。

（1）配制微生物懸浮液。使用接種鏟將一定量的微生物從培養(yǎng)斜面上取下，放入帶玻璃珠和水的三角燒瓶中，震蕩10 min后，雙層紗布過濾，得到1×109CFU/mL的微生物懸浮液備用。

（2）配制樣品。準確稱取樣品，分別用無菌水配制成 5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、800、600、400、200 mg/L和100 mg/L的濃度的溶液。

（3）將配制成一定濃度的樣品20mL加入到180mL熔融的培養(yǎng)基（控制溫度在45℃左右）中搖勻，使實際濃度分別為500、400、300、200、100、80、60、40、20 mg/L 和 10 mg/L。

（4）用無菌吸管將以下含有一定濃度樣品的培養(yǎng)基15mL分別注入培養(yǎng)皿，冷卻凝固。

（5）使用點菌法將待測菌接種到培養(yǎng)基表面，每一皿可點種6種菌。

（6）霉菌培養(yǎng)皿28℃培養(yǎng)3天后檢查結果；細菌培養(yǎng)皿36℃培養(yǎng)2天后檢查結果。無菌落生長的該濃度，為抑制濃度。進一步細化濃度梯度，最終得出準確的該菌最低抑制濃度MIC。

1.3 浸制應用階段試驗實驗

根據(jù)初篩和復篩的實驗結果，對進行藥物濃度梯度的應用性實驗的觀察和檢測[7]，濃度梯度可配5%。分別選取了黃顙魚和鯽魚作為樣本進行浸制實驗，通過4個月的肉眼觀察是否腐敗和長霉，對標本的情況進行了記錄，結果見表3。

2 結果與討論

2.1不同抗菌劑的抑菌效果

實驗不同抗菌劑的抑菌效果，結果見表1。

表1 不同抗菌劑的抑菌效果

根據(jù)初篩選的結果，已經(jīng)可初步判定各試劑抗菌防霉能力的大小[5]，從中挑選出抗菌防霉能力均較強的工業(yè)殺菌劑有CI-14、BIT、MIT、OIT、TCMTB、溴硝醇（BNP）、半縮醛（FC）、DMDMH、BK、PCMC。

2.2 不同殺菌劑濃度的抑菌效果

不同殺菌劑濃度的抑菌實驗，于細菌培養(yǎng)皿36℃培養(yǎng)2天后檢查結果，見表2。

表2 不同殺菌劑對不同菌液的最低抑制濃度（單位：mg/L）

表3 藥物對黃顙魚和鯽魚樣品的防腐效果

根據(jù)數(shù)據(jù)結果，及考慮市場價格的綜合因素，選取三個配方進行下一步的實驗，分別為：（1）MIT、TCMTB；（2）FC、BIT；（3）TCMTB、BIT。三種配方中，藥劑的配比均為1∶1。

2.3 實際應用效果

根據(jù)初篩和復篩的實驗結果，對進行藥物濃度梯度的應用性實驗的觀察和檢測，結果見表3。

根據(jù)實驗結果可知，3號配方在實際應用中效果最好。

3 結論

根據(jù)實驗結果，目前配方可用于小型魚類、無脊椎類標本采集過程中的臨時保存。此配方用來大規(guī)模替代博物館浸制標本的保存作用，還需作進一步的實驗研究。

[1]馬振瀛.防霉學[M].昆明:云南科技出版社,1998.

[2]顧學斌,王磊,馬振瀛,等.抗菌防霉技術手冊[M].北京:化學工業(yè)出版社,2011.

[3]朱艷靜.抗菌纖維簡介[J].工業(yè)微生物,1999,29(2):51-52.

[4]馬淑琴.關于文物霉腐機理的探討[J].北方文物,1996(1):95-96.

[5]辜海彬,陳武勇,趙長青,等.革制品用抗菌紙的制備及抗菌性能研究[J].中國皮革,2008(3):25-28.

[6]朱艷靜,馬振瀛,楊倩華,等.幾種揮發(fā)性藥物的防霉防蛀效果試驗[J].工業(yè)微生物,1997(1):40-42.

[7]朱艷靜,曹惠椿,馬振瀛,等.抗菌纖維的研究[J].紡織科學研究,2001(4):10-16.