王林燕 陶春先 山口佳則 李振慶

文章編號： 1005-5630（2018）06-0007-06

摘要： 細(xì)菌種類的快速識別在牙病防治中具有重要的應(yīng)用價值。以牙周病原菌為研究對象，建立了DNA快速擴(kuò)增的自然對流聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法及毛細(xì)管電泳熒光光學(xué)檢測系統(tǒng)。研究表明，當(dāng)毛細(xì)管有效長度為8 cm、電場強(qiáng)度為100 V/cm時，50 bp DNA ladder在篩分介質(zhì)為0.5%HEC（羥乙基纖維素）（1 300 K）中的分離效果最佳。毛細(xì)管電泳結(jié)果表明，采用自然對流法可以在25 min內(nèi)在圓柱腔體中實(shí)現(xiàn)牙周病原菌的快速PCR。

關(guān)鍵詞： 毛細(xì)管電泳系統(tǒng); 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）; 自然對流

中圖分類號： O 657.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2018.06.002

引言

牙周病僅次于齲病，是危害人類牙齒健康的第二大口腔疾病，通常是由齦下菌斑引起的[1-3]。人口腔內(nèi)的細(xì)菌附著在牙齒表面形成牙菌斑，當(dāng)這些細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入牙齦，便會引起牙齦纖維溶解及炎癥，炎

癥導(dǎo)致牙槽骨吸收，隨之牙齒出現(xiàn)松動甚至脫落[4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，90%～95%的老年人都患有不同程度的牙周病，這也是人牙齒過早脫落的主要原因。同時，研究表明，牙周病還與中風(fēng)、冠心病、糖尿病等疾病有一定的關(guān)系。隨著我國進(jìn)入老齡化社會，這一健康問題將日益突出，為此，及時發(fā)現(xiàn)早期牙周病癥，并對其加以控制和治療，對牙齒健康具有重要的意義。

研究表明，在一些破壞性牙周病及其傳播中，特異性病原菌的作用成為大家研究的焦點(diǎn)。在這些牙周病致病菌中，革蘭氏陰性桿菌如齒垢密螺旋體（treponema denticola，T.d）等被認(rèn)為是與牙周病發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)的細(xì)菌[5]。它們在牙周病患者的口腔中大量生存，而在健康者口腔中沒有發(fā)現(xiàn)或存在數(shù)量極少。為此，微生物檢測有助于實(shí)現(xiàn)牙周病的早期診斷。雖然目前有細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、熒光抗體法[6]等方法對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和檢測，但這些方法因費(fèi)時、費(fèi)力、缺乏準(zhǔn)確性，使牙周病致病菌的檢驗(yàn)在臨床應(yīng)用上受到很大限制，難以推廣。因此，建立快速的菌種檢測方法對研究牙周病致病菌及牙周病預(yù)防和治療有非常重要的意義。

盡管現(xiàn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[7-9]（polymerase chain reaction，PCR）方法效率相對較高，但是傳統(tǒng)的PCR熱循環(huán)儀受變溫效率的限制，DNA樣品擴(kuò)增時間相對較長。為此，本文基于自然對流理論，在試建的便攜式自然對流PCR（natural convection PCR，NCPCR）系統(tǒng)中對齒垢密螺旋體實(shí)現(xiàn)了快速PCR，并采用毛細(xì)管電泳法[10-11]對其PCR產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了快速檢測。

1原理及方法

自然對流PCR[12-13]是在一個圓柱型腔體內(nèi)進(jìn)行的，腔體的上表面保持低溫（55 ℃），下表面保持高溫（97 ℃）。由于上下表面溫度差使得腔體內(nèi)不同位置流體的密度分布不同，溫度高的流體密度小，溫度低的流體密度大，從而使得底部液體上升，腔內(nèi)頂部液體下降，最終使得液體在腔體內(nèi)形成對流循環(huán)。當(dāng)腔體內(nèi)注入含有DNA模板及引物的PCR反應(yīng)液時，通過優(yōu)化圓柱腔體的幾何尺寸，腔體反應(yīng)液便可以攜帶DNA經(jīng)PCR的不同溫區(qū)，最終實(shí)現(xiàn)DNA的自然對流PCR。

依據(jù)電泳的基本原理，實(shí)驗(yàn)室自制了毛細(xì)管電泳熒光光學(xué)檢測系統(tǒng)，如圖1所示，其核心部件為石英毛細(xì)管（Polymicro Technologies，美國）、正置顯微鏡BX51（奧林巴斯，日本）、MODEL 610E高壓電源（Trek公司，美國）。 其工作原理如下：汞燈光源發(fā)出的光經(jīng) UMWIB3濾光片（奧林巴斯，日本）過濾后產(chǎn)生波長為494 nm的激發(fā)光;DNA與熒光染料SYBR Green I結(jié)合物在高壓電場下流經(jīng)毛細(xì)管，當(dāng)DNA經(jīng)過毛細(xì)管窗口時，受入射光激發(fā)（494 nm），產(chǎn)生中心波長為521 nm的熒光;熒光經(jīng)光電倍增管R928（濱松光子學(xué)株式會社，日本）收集，獲得DNA的電泳圖譜，經(jīng)CCD收集，可獲取DNA在毛細(xì)管內(nèi)的運(yùn)動圖像。為降低電滲流，采用線性聚丙烯酰胺對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行鍍膜處理，電泳過程是在25 ℃的恒溫暗室中完成。

2試劑配制

2.1PCR反應(yīng)試劑配制

在研制的便攜式自然對流PCR系統(tǒng)中對齒垢密螺旋體T.d實(shí)施PCR反應(yīng)。T.d引物為5′AAGGCGGTAGAGCCGCTCA3′和5′AGCCCGCGCTCA3′（生工生物工程（上海）股份有限公司），對應(yīng)的PCR產(chǎn)物片段為283 bp（bp表示堿基對）。將3.5 μL 10×Fast Buffer I、2.7 μL dNTP Mixture、0.7 μL T.d DNA模板、0.7 μL引物、0.175 μL SpeedSTAR HS DNA Polymerase（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）、26.525 μL滅菌水混合于離心管內(nèi)。

2.2電泳試劑配制

用電子天平稱取0.05 g的羥乙基纖維素（hydroxyethyl cellulose，HEC）（1 300 K），取9.95 mL 0.5×TBE（TrisborateEDTA，TBE）緩沖液，將HEC緩緩倒入0.5×TBE緩沖液中，之后將HEC溶液置于磁力攪拌器上攪拌一周。取99 μL的HEC溶液和1 μL的100×SYBR Green I 配置成篩分溶液，取2 μL的50 bp DNA ladder（北京索萊寶科技有限公司）和98 μL的水配置成1.8 ng/μL樣品溶液。

2.3PCR反應(yīng)液稀釋

從自然對流圓柱腔體中取出35 μL PCR溶液，放置于離心管，再往離心管中加入35 μL的純凈水，將反應(yīng)液稀釋50%。

3結(jié)果與討論

3.1篩分介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對DNA分離效率的影響

篩分介質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定了高分子線團(tuán)在溶液中的分布狀態(tài)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，高分子線團(tuán)之間相互分離，隨著篩分介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，高分子線團(tuán)之間相互交纏，分離DNA的能力也隨之增加。為此，研究了電場強(qiáng)度為100 V/cm時，HEC（1 300 K）篩分介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對小片段DNA（<500 bp）的分離能力。研究顯示：當(dāng)HEC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時，盡管可以在6 min內(nèi)分離出DNA，但相鄰DNA片段幾乎重疊在一起，分離度較低，見圖2（c）;當(dāng)HEC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，雖然分離時間有所增加，但是相鄰DNA之間分離度明顯提高，見圖2（b）;當(dāng)HEC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時，分離時間與分離度變化較小，見圖2（a）。為此，本實(shí)驗(yàn)以0.5%HEC為篩分介質(zhì)分離DNA。

3.2電場強(qiáng)度對DNA分離效率的影響

由于DNA經(jīng)磷酸基團(tuán)水解后帶負(fù)電，當(dāng)毛細(xì)管兩側(cè)施加電壓時，電場強(qiáng)度決定了DNA在電泳緩沖液中所受電場力的大小。電場力越大，DNA運(yùn)動速度越快，分析時間越短;反之，電場力越小，DNA運(yùn)動速度較慢，分析時間延長。為此，研究了其他電泳條件一定時，電場強(qiáng)度對毛細(xì)管電泳分離DNA 能力的影響。圖3顯示了DNA 樣品在80 V/cm、100 V/cm、120 V/cm電場強(qiáng)度下的分離結(jié)果：隨著電場強(qiáng)度的增加，DNA分析時間由11 min降低至7.5 min以內(nèi);當(dāng)電場強(qiáng)度由100 V/cm升高至120 V/cm時，250 bp與300 bp DNA ladder之間分離度明顯降低，整個DNA樣品分析時間無明顯縮短。為此，采用100 V/cm電場強(qiáng)度分離DNA樣品。

3.3毛細(xì)管有效長度對DNA分離效率的影響

毛細(xì)管有效長度決定了DNA片段在毛細(xì)管中的實(shí)際遷移距離。毛細(xì)管有效長度越小，DNA在篩分介質(zhì)中遷移距離越短，DNA分析時間越短。然而，若毛細(xì)管有效長度過小，DNA尚未分離便已運(yùn)動至檢測窗口，會造成相鄰DNA片段間分離度過低。為此，研究了其他電泳條件一定時，毛細(xì)管有效長度對DNA分離結(jié)果的影響。圖4為毛細(xì)管總長度為15 cm、電場強(qiáng)度為100 V/cm時，50 bp DNA ladder在不同的毛細(xì)管有效長度時的分離結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)毛細(xì)管有效長度從7 cm增加至9 cm時，電泳分離時間由6.7 min增加至8 min，相鄰DNA片段間分離度變化不明顯;當(dāng)有效長度為8 cm時，分離效果最佳。

3.4毛細(xì)管電泳檢測自然對流PCR產(chǎn)物

將底面直徑為1.5 mm、高為15 mm的圓柱腔體作為自然對流PCR反應(yīng)腔體，圓柱腔體由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料制成。底面與上表面分別施加溫度97 ℃與55 ℃，PCR反應(yīng)液在圓柱腔體內(nèi)反應(yīng)25 min后將牙周病原菌T.d PCR產(chǎn)物取出，稀釋至50%后實(shí)施電泳，在優(yōu)化的電泳條件下采用毛細(xì)管電泳檢測其PCR產(chǎn)物。圖5為電場強(qiáng)度100 V/cm，毛細(xì)管有效長度為8 cm，50 bp DNA ladder與T.d PCR產(chǎn)物在0.5%HEC（1 300 K）中的分離結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，目標(biāo)產(chǎn)物電泳峰位于250 bp與300 bp電泳峰之間，表明在DNA圓柱腔體中可以成功實(shí)現(xiàn)自然對流PCR。

4結(jié)語

建立了基于自然對流的PCR方法，搭建了共聚焦熒光毛細(xì)管電泳光學(xué)檢測系統(tǒng)。在該檢測系統(tǒng)中以50 bp DNA ladder為研究對象，研究了篩分介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、電場強(qiáng)度及有效毛細(xì)管長度對DNA分離效率的影響。在圓柱型腔體中對齒垢密螺旋體實(shí)施了PCR。毛細(xì)管電泳結(jié)果表明，采用自然對流方法可以在25 min內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)PCR，后續(xù)工作將會設(shè)計高通量自然對流PCR芯片。

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（編輯：劉鐵英）