豬圓環(huán)病毒2型與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的診治

諶春燕，楊克禮

（1．湖北省襄陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北 襄陽 441021；2．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

豬圓環(huán)病毒（Porcine cirovirus，PCV）是近年來危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一，根據(jù)其基因組不同分為豬圓環(huán)病毒1型 （Porcine cirovirus type 1，PCV1）和豬圓環(huán)病毒 2 型（Porcine cirovirus type 1，PCV2）。 PCV1 對動物沒有致病作用，PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原。該病多以5～12周齡的仔豬發(fā)病率較高，主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、貧血、進行性消瘦、生長遲緩、偶有黃疽和腹瀉等。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種豬的重要傳染病。該病以妊娠母豬死產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙以及各生長階段豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征。2006年，我國南方地區(qū)暴發(fā)了由PRRSV高致病性突變株引起的高發(fā)病率、高死亡率的HPPRRS，近年來在我國豬群中仍有流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［1，2］。

PCV2和PRRSV感染豬后均可損壞其免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，兩種病毒的共感染具有明顯的協(xié)同致病作用。高致病性PRRSV的出現(xiàn)及其與PCV2的共感染明顯提高了豬群的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的威脅。

2017年5月，襄陽某500頭基礎(chǔ)母豬場的豬只先后大量發(fā)病，各階段的豬均有發(fā)病和死亡，持續(xù)近30 d，經(jīng)濟損失較大。臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱（體溫升高至41℃左右），食欲下降，呼吸困難、咳嗽，部分病豬皮膚發(fā)紅，部分病豬皮膚蒼白，部分母豬流產(chǎn)，仔豬和母豬均有死亡。剖檢病變主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，腎表面有出血點，脾腫大，頜下淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)腫大。筆者將豬場送檢的病料送至湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進行PCR檢測，診斷為PCV2和HP－PRRSV的混合感染。根據(jù)臨床及實驗室診斷結(jié)果，我們提出了綜合防控技術(shù)方案，經(jīng)實施后，疫情得到了有效控制?，F(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1．1 病料

發(fā)病場送檢病豬脾、肺及淋巴結(jié)等組織樣品共8份。

1．2 主要試劑

病毒DNA／RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker等均購自TaKaRa公司；PCV2及PRRSV檢測引物由上海Sangon生物工程公司合成。

1．3 病毒核酸的提取

將病料組織與DMEM溶液按1∶5混合，充分勻漿，－80℃至室溫反復(fù)凍融3次，立即提取核酸或置－80℃保存?zhèn)溆?。病毒核酸的提取利用病毒DNA／RNA提取試劑盒按照說明書操作進行。

1．4 PCV2 PCR 擴增

取提取的DNA，使用針對PCV2 ORF2基因設(shè)計的引物，上游引物 PCV2－F：5’－CGAGCTCATGACG TATCCAAGGAGGC－3’，下游引物 PCV2－R：5’－CCC AAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG－3’進行 PCR 擴增，產(chǎn)物預(yù)期大小約720 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol／L）2 μL，上、下游引物各 1μL，模板 DNA 4μL，Taq 酶0．5μL（5U／μL），加滅菌超純水至50μL；PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃變性 5 min，94℃變性 1 min，56℃退火 45 s，72℃延伸1min，共進行30個循環(huán)，72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外觀測儀下觀察記錄結(jié)果。

1．5 PRRSV 一步法 RT－PCR 擴增

PRRSV 一步法 RT－PCR 擴增參照 Yang 等［3］的文獻進行，PRRSV經(jīng)典株P(guān)CR預(yù)期產(chǎn)物大小約330 bp、PRRSV高致病性變異株P(guān)CR預(yù)期產(chǎn)物大小約240 bp。 50 μL 反應(yīng)體系包括：5 μL 10×buffer，0．5 μL Taq polymerase（5 U／μL），0．5 μL reverse transcriptase（5 U／μL），0．5 μL RNase inhibitor （40 U／μL），4 μL RNA模板，5μL dNTP （10 mmol／L），1μL PRRSV NSP2－F（100 μmol／L），1 μL PRRSV NSP2－R（100 μmol／L）和 32．5 μL 滅菌水。PCR 擴增參數(shù)如下：45℃30min，94℃ 5 min；擴增條件為 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s；30 個循環(huán)后，72 ℃延伸 10 min。 取 5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外觀測儀下觀察記錄結(jié)果。

1．6 防治措施

全面消毒：用漂白粉、氫氧化鈉或生石灰對豬舍進行一次全面的消毒，并堅持每周對豬舍徹底消毒1～2次。

緊急接種：對無明顯癥狀的豬只，分別緊急免疫自家苗 2～4 mL。

對癥治療：對出現(xiàn)繼發(fā)感染的豬只，應(yīng)用抗菌藥物進行治療，如環(huán)丙沙星、頭孢類藥物等；對呼吸困難的豬只使用止咳平喘藥物，如麻黃堿、氨茶堿等；對高熱豬只使用退熱藥物，如安乃近、氨基比林等。

輔助治療：豬圓環(huán)病毒與豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為病毒性疫病，使用抗生素治療無效，只能對癥治療并控制繼發(fā)感染。建議配合使用病毒靈、干擾素、免疫球蛋白、高免血清等廣譜抗病毒的藥物進行輔助治療，同時可配合使用甘草合劑、黃芪多糖等增強免疫力的藥物。

加強管理：定期對豬舍、用具等設(shè)施進行滅菌消毒；禁止閑雜人員、外來車輛等出入，防止外來病原傳染；對病死豬進行無害化處理；一旦發(fā)現(xiàn)疫情，及時上報并隔離，避免疫情進一步擴散；定期進行免疫接種，做好預(yù)防工作。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCV2 PCR 檢測結(jié)果

以病豬組織中提取的病毒DNA為模板，利用設(shè)計的PCV2特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果所檢測的8份組織樣品有7份擴增出與PCV2預(yù)期擴增產(chǎn)物大小一致的目的條帶，即為PCV2陽性（圖1）。

圖1 PCV2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2．2 PRRSV RT－ PCR 檢測結(jié)果

以病豬組織中提取的病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，利用設(shè)計的PRRSV特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果所檢測的8份組織樣品均擴增出與HPPRRSV預(yù)期擴增產(chǎn)物大小一致的目的條帶，即為HP－PRRSV 陽性（圖 2）。

圖2 PRRSV RT－PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

綜合以上結(jié)果可知，除一份組織樣品為PCV2陰性外，其他組織樣品檢測結(jié)果豬圓環(huán)病毒2型和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)判定該豬場本次暴發(fā)的疫情為豬圓環(huán)病毒2型和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染導(dǎo)致。

2．3 防治效果

采用上述綜合防控措施10 d后，該豬場的病情逐步得到控制，30 d后疫情平息，生產(chǎn)恢復(fù)正常并逐步達到發(fā)病前的水平。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)實驗室分子生物學(xué)檢測結(jié)果，PCV2的陽性率為 87．5%（7／8），HP－PRRSV 的陽性率為 100%（8／8），結(jié)合臨床癥狀、剖檢病理變化，確診該豬場發(fā)生的疫病為PCV2與HP－PRRSV的混合感染。

PCV2和HP－PRRSV都會導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫抑制，抵抗力降低，容易引起其他病毒或細菌的繼發(fā)或并發(fā)感染，從而引起感染豬的大量死亡［4－6］。臨床上，PCV2與HP－PRRSV的混合感染與其他病原體感染所引起的呼吸系統(tǒng)疫病的表現(xiàn)極為相似，并常伴隨其他混合感染或（和）繼發(fā)感染。因此，僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀以及剖檢變化很難對疫病作出正確診斷。PCR方法是當前的一種快速簡便、準確可靠的檢測方法，可以用于臨床診斷。

由于PCV2和HP－PRRSV均是病毒性疫病，臨床上使用常規(guī)的方法控制其混合感染效果很不理想。本研究中使用自家苗進行防治，配合注射敏感抗生素、免疫增強劑等，同時采用加強飼養(yǎng)管理等綜合防控措施，取得了理想的防治效果。自家苗是在無菌條件下采集病豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織經(jīng)過甲醛滅活制成的，可用于發(fā)病場或發(fā)病地區(qū)PCV2與HP－PRRSV混合感染的防治，但由于安全性等因素尚不能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。臨床使用時應(yīng)先做安全性試驗，若有不良反應(yīng)出現(xiàn)，需立即停止使用［7］。

PCV2和PRRSV均可以破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬免疫系統(tǒng)抑制。已有的研究表明，這兩種病毒在豬體內(nèi)可以相互促進增殖，混合感染具有明顯的協(xié)同致病作用，可以加重或者擴大感染豬免疫器官的病理變化，導(dǎo)致更加嚴重的免疫抑制，使得機體對豬瘟、口蹄疫等疫苗抗體的生成產(chǎn)生抑制，造成豬群的主動免疫抗體滴度不足，導(dǎo)致豬瘟、口蹄疫等疫病的暴發(fā)［8］。因此，加強對豬場PCV2和PRRSV的預(yù)防，對豬場其他疫病的防控有著重要的意義。

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