邱柏圣 杜君 張艷輝 王晴 陳薇 王坤 張超 姚欣

膀胱癌在世界惡性腫瘤中位居第9位，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在美國，每年約有7.4萬例患者被診斷為膀胱癌，男、女性膀胱癌發(fā)病率分別占男、女性惡性腫瘤發(fā)病率的第4位及第11位［1］。在中國，每年約有5.6萬例膀胱癌新發(fā)病例，2.6萬例患者死于該病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）。NMIBC分期、病理分級是疾病復(fù)發(fā)進展的關(guān)鍵預(yù)測因子，同時也是指導(dǎo)患者個體化精準治療的關(guān)鍵。病理學診斷是判斷NMIBC分期、病理分級的金標準，但標本質(zhì)量易受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of the bladder，TURBT）的影響，如膀胱腫瘤組織被燒灼、電切未能切到膀胱肌層等［2］，而病理學專家判斷NMIBC的分期、病理分級中也存在明顯的差異［3］。因此迫切需要客觀的臨床指標以有效地判斷NMIBC分期與病理分級。

近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，許多與NMIBC相關(guān)的免疫組織化學指標逐漸被應(yīng)用于臨床。目前研究證實Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2是腫瘤進展的重要預(yù)測指標［4］，但預(yù)測其與NMIBC分期及病理分級關(guān)系的研究鮮見。本研究旨在通過分析NMIBC患者的臨床病理資料及Ki-67、TP53、Cy?clin D1、HER-2表達與腫瘤分期、病理分級之間的關(guān)系，探究判斷NMIBC分期、病理分級的客觀指標，為臨床診斷及治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年1月至2016年12月184例就診于天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院行TURBT且術(shù)后經(jīng)病理證實為Ta、T1期NMIBC患者的臨床病理資料。患者年齡為26～90歲，平均年齡58歲。患者的腫瘤大?。? cm為142例（77.2%），腫瘤大小≥3 cm為42例（22.8%）；腫瘤單發(fā)113例（61.4%），腫瘤多發(fā)71例（38.6%）；腫瘤初發(fā)149例（81.0%），腫瘤復(fù)發(fā)35例（19.0%）。術(shù)后病理G1與G2級102例（55.4%），G3級82例（44.6%）；Ta期125例（67.9%），T1期59例（32.1%）。

1.2 方法

采用免疫組織化學法檢測病理組織切片中Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2表達。SP試劑盒、兔抗人Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2單克隆抗體及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，實驗步驟嚴格按照試劑說明進行。采用雙盲法，由兩位資深病理醫(yī)師分別閱片。在顯微鏡下隨機選取5個不同視野（×400），每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞的百分比（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）。陽性細胞的百分比大于最佳臨界點者定義為高表達，陽性細胞的百分比小于最佳臨界點者定義為低表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用ROC曲線法確定免疫組織化學各指標的最佳臨界值。單因素分析采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic風險回歸模型，計算并比較變量的靈敏度及特異度。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學法檢測各指標的表達

利用ROC曲線確定Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2陽性細胞百分比的最佳臨界點，分別為25%、75%、45%、70%。Ki-67高表達陽性率為41.8%（77/184），TP53高表達陽性率為27.7%（51/184），Cyclin D1高表達陽性率為84.2%（155/184），HER-2高表達陽性率為22.8%（42/184）。Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2指標高、低表達的比較見圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測各指標的高、低表達（SP法×400）

2.2 患者臨床病理特征及免疫組織化學各指標高、低表達與NMIBC分期、病理分級的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑與NMIBC分期、病理分級呈正相關(guān)（P＜0.05）；NMIBC的T1期及病理G3級組織中的Ki-67及HER-2高表達，與NMIBC分期、病理分級呈正相關(guān)（P＜0.05）；NMIBC的Ta期及病理G1、G2級組織中的Cyclin D1高表達，與NMIBC分期、病理分級呈負相關(guān)（P＜0.05，表1）。將單因素有意義的指標納入Logistic回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示Ki-67高表達、Cyclin D1低表達為NMIBC的T1期獨立預(yù)測因素（P＜0.01）；Ki-67高表達、HER-2高表達、Cyclin D1低表達為NMIBC的病理G3級獨立預(yù)測因素（P＜0.01，表2）。

表1 184例NMIBC患者臨床病理特征及免疫組織化學各指標與腫瘤分期、病理分級的關(guān)系

表2 患者臨床病理特征及免疫組織化學各指標與NMIBC分期、病理分級關(guān)系的Logistic多因素分析

2.3 免疫組織化學法檢測各指標的靈敏度與特異度

免疫組織化學指標Ki-67預(yù)測NMIBC分期和病理分級的靈敏度和特異度較Cyclin D1、HER-2高（表3）。

表3 免疫組織化學指標預(yù)測NMIBC分期、病理分級的靈敏度與特異度

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，首診患者中約75%被診斷為NMIBC，超過50%NMIBC患者術(shù)后2年復(fù)發(fā)，45%患者進展為MIBC。Holm?ng等［5］研究應(yīng)用歐洲泌尿外科協(xié)會指南推薦的EORTC危險評分系統(tǒng)，對NMIBC患者復(fù)發(fā)進展風險進行評估，其中病理分級按照世界衛(wèi)生組織（WHO）分級法（1973年）將患者分為低危組、中危組、高危組，精確地制定出治療方案，而NMIBC的T分期、病理分級是EORTC危險評分系統(tǒng)的兩個關(guān)鍵分層指標。研究發(fā)現(xiàn)，NMIBC分期、病理分級的一致率僅為50%～60%［6-7］。近年來，膀胱癌的很多分子標志物逐漸被應(yīng)用于臨床，如果可應(yīng)用這些客觀的指標協(xié)助判斷NMIBC分期、病理分級，則可以幫助臨床醫(yī)生制定下一步治療方案，從而改善患者預(yù)后，避免治療不足或過度治療。

Ki-67是一種大分子增殖細胞核蛋白，除G0期外在細胞周期各個階段均表達，能反映乳腺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的細胞增殖活性。Wang等［8］研究了270例NMIBC患者臨床病理特征及免疫組織化學指標發(fā)現(xiàn)，Ki-67增殖活性與NMIBC患者分期、病理分級呈正相關(guān)。此外，Otto等［9］研究結(jié)果表明，膀胱癌患者組織中的Ki-67高表達具有較差的無復(fù)發(fā)生存率（recurrence free survival，RFS）、無進展生存率（progression free survival，PFS）和腫瘤特異性生存率（cancer specific survival，CSS）。對膀胱癌T1期病理G3級的亞組分析結(jié)果顯示，Ki-67高表達是預(yù)測NMIBC進展、復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子［10］。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達是NMIBC的T1期和病理G3級的獨立預(yù)測因素，與上述研究結(jié)果基本一致，并且免疫組織化學指標Ki-67在預(yù)測NMIBC分期和病理分級中有較高的靈敏度和特異度，因此可應(yīng)用該指標協(xié)助臨床醫(yī)生判斷NMIBC分期與病理分級。

HER-2是跨膜酪氨酸激酶受體家族成員之一，HER-2基因擴增與乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌多種惡性腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。有研究證實，膀胱癌組織中的HER-2高表達患者的分期和病理分級均較高，預(yù)后較差［11］，但也有研究并未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性［12］。因此，HER-2基因擴增和蛋白高表達在膀胱癌中的意義并不十分明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HER-2高表達與NMIBC分期、病理分級相關(guān)，是NMIBC病理G3級獨立預(yù)測因素。一項Meta分析結(jié)果顯示，HER-2基因擴增與膀胱癌高分級、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其PFS和無病生存率（disease free survival，DFS）均較低［11］。Chen等［13］研究發(fā)現(xiàn)HER-2基因擴增與NMIBC病理G3級相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。免疫組織化學檢測指標HER-2預(yù)測NMIBC分期、病理分級的靈敏度與特異度較Ki-67低。

Cyclin D1是一種常見的細胞周期調(diào)節(jié)因子。在正常細胞周期中，Cyclin D1與CDK4、CDK6形成復(fù)合物，使Rb蛋白磷酸化而失活，從而使細胞周期從G1期進入S期，完成細胞增殖［14］。Cyclin D1高表達能縮短G1期，促使細胞提前進入S期，引起細胞生長失控、轉(zhuǎn)化和癌變。El-Gendi等［15］分析了 100 例行TURBT的膀胱癌患者的臨床病理特征與免疫組織化學指標的相關(guān)性，研究結(jié)果顯示Cyclin D1表達與膀胱癌分期（NMIBCvs.MIBC）、病理分級（lowvs.high）均無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，NMIBC的Ta期及病理G1、G2級組織中的Cyclin D1高表達，與腫瘤分期及病理分級呈負相關(guān)；Cyclin D1低表達是NMIBC患者T1期及病理G3級的獨立預(yù)測因素。各研究結(jié)果差異的原因，可能由于研究機構(gòu)采用免疫組織化學染色方法存在差異，以及選取的cut off值未能統(tǒng)一所導(dǎo)致。但免疫組織化學指標Cyclin D1預(yù)測NMIBC分期及病理分級的靈敏度與特異度也較Ki-67低。

綜上所述，本研究選取的免疫組織化學指標Ki-67的表達水平與NMIBC分期、病理分級呈正相關(guān)，是判斷NMIBC分期、病理分級的獨立預(yù)測因素，由于其敏感性及特異性較高、操作方便，對NMIBC分期、病理分級判斷較困難的患者具有鑒別意義，適用于臨床應(yīng)用。但本研究屬于回顧性分析，在患者選擇上可能存在偏倚，樣本量較少且為單中心研究，尚需更大樣本量的驗證。

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