徐若烊,王大慧,許宏慶,衛(wèi)功元

(蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院,江蘇蘇州 215123)

S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)均為廣泛存在于生物體內的含硫小分子活性化合物。SAM由底物L-蛋氨酸和ATP經S-腺苷蛋氨酸合成酶催化合成,參與生物體內40多種生化反應,具有轉甲基、轉硫和轉氨丙基等作用[1-2]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸反應生成的活性三肽物質,在維持生物體內適宜的氧化還原環(huán)境、保護蛋白質的巰基免受氧化、清除細胞內活性氧自由基等方面具有重要作用[3-4]?；赟AM和GSH在細胞內的重要生理功能,這兩種含硫化合物在臨床醫(yī)學、運動保健、食品加工和化妝品等諸多領域均具有廣泛的應用前景。

目前,SAM和GSH的生產方法主要有化學合成法、酶促轉化法和微生物發(fā)酵法,其中酵母發(fā)酵法是最具有潛力的方法[5-6]。在酵母細胞中,作為L-蛋氨酸代謝途徑中的關鍵節(jié)點物質,SAM和GSH可以通過聯產發(fā)酵的方法進行生產[7-9]。SAM和GSH的生物合成均需要ATP的參與,胞內能量物質的水平是決定SAM和GSH能否聯合高產的關鍵因素[10]。前人研究發(fā)現,外源ATP的添加可以有效促進SAM和GSH的高產[11-12],但該方法并不經濟。如果能設法提高酵母細胞內源性ATP的含量,則有可能提高SAM和GSH的聯產水平。

針對胞內ATP水平的調控,常用的方法為優(yōu)化分批發(fā)酵的供氧水平或添加外源的輔助性能源物質[13]。為了實現SAM和GSH聯合高產,前期研究采用了兩階段溶氧控制策略,SAM和GSH聯產量比恒定轉速條件下提高6.5%[14]。此外,在分批發(fā)酵的6 h向發(fā)酵液中添加10 g/L檸檬酸鈉,SAM和GSH聯產量比未添加的對照組提高了13%[15]。然而,這些發(fā)酵優(yōu)化策略促進SAM和GSH聯合高產的生理學機制仍有待明確。

丙酮酸鈉是一種化學工業(yè)中常用的廉價化合物,在好氧發(fā)酵過程中可以作為替代碳源或能量輔助物質,進而提高目標產物的高產[16]。為此,本文擬研究丙酮酸鈉對SAM和GSH聯產發(fā)酵的影響,從發(fā)酵動力學、關鍵酶活性和胞內能量物質水平及比率等角度對丙酮酸鈉促進SAM和GSH聯產發(fā)酵的生理機制進行解析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產朊假絲酵母(CandidautilisSZU 07-01) 為蘇州大學微生物生理與代謝調控研究室保藏;SAM、GSH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)、谷胱甘肽還原酶、丙酮酸鈉、L-蛋氨酸、蛋白胨和酵母膏等 生工生物工程(上海)股份有限公司;硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀和氯化鈣 國藥集團化學試劑有限公司;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、己糖激酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司;種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母粉10 g/L,pH6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖35 g/L,硫酸銨10 g/L,磷酸二氫鉀12.3 g/L,蛋氨酸4.6 g/L,硫酸鎂0.05 g/L,氯化鈣0.05 g/L,pH5.0。

5 L Minifors攪拌式發(fā)酵罐 瑞士Infors公司;Waters 1525高效液相色譜儀 美國Waters公司;LD5-2A離心機 北京京立離心機有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HZ-2010K搖床 上海欣蕊自動化設備有限公司;SW-CJ-2A超凈工作臺 吳江市龍宏凈化設備有限公司;LDZX-50KB滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 取-70 ℃冷藏種子活化后接入種子培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)20 h,溫度30 ℃、搖床轉速200 r/min。

1.2.2 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 按10%(v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)30 h,溫度30 ℃,搖床轉速200 r/min。

1.2.3 丙酮酸鈉添加對SAM和GSH聯產發(fā)酵的影響 在搖床培養(yǎng)條件下,以不添加丙酮酸鈉作為對照,分別在0 h、對數生長期中期(6 h)和葡萄糖消耗結束時(12 h)添加1、2、3和4 g/L的丙酮酸鈉,培養(yǎng)至30 h,取樣測定生物量、SAM和GSH濃度,比較酵母細胞生長、SAM和GSH合成情況,總結丙酮酸鈉對SAM和GSH聯產發(fā)酵的影響規(guī)律。

1.2.4 分批發(fā)酵培養(yǎng) 按10%(v/v)的接種量將種子接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,在30 ℃、350 r/min和1 vvm條件下通氣培養(yǎng)30 h。pH采用梅特勒電極在位監(jiān)測,通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH進行調節(jié),以維持pH變化在5.0±0.02范圍內。在分批培養(yǎng)的不同時間定時取樣,樣品經處理后檢測細胞生長、SAM和GSH合成情況。

1.2.5 丙酮酸鈉促進SAM和GSH聯產發(fā)酵生理機制解析 在產朊假絲酵母分批培養(yǎng)條件下,以不添加丙酮酸鈉作為對照組,以在搖瓶中優(yōu)化后的方法進行丙酮酸鈉添加作為丙酮酸鈉組,定時取樣,檢測胞內能量物質NADH、NAD+、ATP和ADP含量,測定胞內γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、S-腺苷蛋氨酸合成酶、己糖激酶和異檸檬酸脫氫酶活性,通過比較實驗組和對照組胞內能量物質水平和比率以及關鍵酶活性大小,解析丙酮酸鈉促進產朊假絲酵母聯產SAM和GSH的生理機制。

1.2.6 酵母生物量和葡萄糖濃度的測定 以細胞干重(DCW)表示酵母生物量。取10 mL發(fā)酵液于3500 r/min下離心10 min,蒸餾水洗滌3次,相同轉速下離心10 min,收集菌體,70 ℃烘干至恒重;葡萄糖濃度的測定采用3,5二硝基水楊酸法[17]。

1.2.7 胞內SAM、GSH的提取 分別采用0.35 mmol/L硫酸和40%(v/v)乙醇對胞內SAM和GSH進行提取[18]。

1.2.8 代謝物質濃度測定 胞內能量物質如NADH、NAD+、ATP和ADP的定量測定方法,SAM和GSH的定量測定方法,以及胞內SAM含量(ISC)和GSH含量(IGC)的定義及計算方法,參見文獻[18]。

1.2.9 酶活測定γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、己糖激酶(HK)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)采用試劑盒進行測定,操作方法和步驟按照說明書進行;S-腺苷蛋氨酸合成酶(MAT)通過測定酶促反應液中的SAM含量來進行檢測[19]。

1.3 數據處理與分析

所有搖瓶實驗數據均為三組獨立實驗樣品的平均值,所有分批發(fā)酵實驗數據均為兩次檢測結果的平均值。實驗數據采用SPSS 17.0軟件(IBM公司)進行統(tǒng)計分析,數據的可信度采用t-檢驗進行分析,當p<0.05時認為有顯著影響。

表1 丙酮酸鈉添加對SAM和GSH生物合成的影響Table 1 Effect of sodium pyruvate addition on the biosynthesis of SAM and GSH

注:同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),字母相同代表差異不顯著(p>0.05)。

2 結果與討論

2.1 丙酮酸鈉對產朊假絲酵母生物合成SAM和GSH的影響

搖瓶培養(yǎng)條件下,考察丙酮酸鈉在C.utilisSZU 07-01生物合成SAM和GSH中的作用,結果如表1所示?？梢钥闯?與不添加丙酮酸鈉的空白對照相比,丙酮酸鈉添加沒有促進酵母細胞的生長,細胞干重變化不大。然而,在酵母細胞生長的前期(如0 h)添加丙酮酸鈉有利于SAM和GSH的生物合成,SAM和GSH聯產量均有所提高。在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉時,SAM和GSH聯產量達到433.4 mg/L,是對照實驗條件下的1.29倍。由此,以下選用0 h添加2 g/L丙酮酸鈉作為分批發(fā)酵培養(yǎng)條件,深入研究丙酮酸鈉對SAM和GSH聯產發(fā)酵的影響及其生理機制。

2.2 丙酮酸鈉在SAM和GSH聯產發(fā)酵中的作用

在5 L發(fā)酵罐中對C.utilisSZU 07-01進行分批培養(yǎng),根據表1中較優(yōu)的方法添加丙酮酸鈉(即在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉),考察細胞生長以及SAM和GSH合成情況,結果如圖1所示。SAM和GSH聯產發(fā)酵過程參數比較總結于表2。與搖瓶培養(yǎng)所呈現的結果不同,添加丙酮酸鈉在溶解氧充足的情況下,促進了細胞的生長,至18 h時,細胞干重達到最大值,比對照提高了20.5%。在好氧發(fā)酵中,酵母細胞代謝丙酮酸鈉產生了大量的能量物質,這將大大節(jié)約用于能量合成的葡萄糖的消耗,最終有更多的葡萄糖參與細胞生長,進而提高了細胞干重的水平。

表2 SAM和GSH聯產發(fā)酵過程參數比較Table 2 Comparison of kinetic parameters involved in batch co-production of SAM and GSH

注:同行中不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),字母相同代表差異不顯著(p>0.05)。

與此同時,丙酮酸鈉的添加也提高了SAM和GSH的合成速率,SAM和GSH的產量一直高于對照實驗結果(圖1B、圖1C)。至27 h時,GSH產量達到最大值222.2 mg/L,比對照組提高了18.1%;至30 h時,SAM產量達到最大值191.2 mg/L,比對照組高出53.2%。最終,SAM和GSH聯產量在27 h達到最大值402.3 mg/L,比對照提高35.1%(表2)。

進而對不同發(fā)酵時間下的酵母胞內SAM和GSH含量進行比較,結果如圖2所示?？梢园l(fā)現,丙酮酸鈉的添加有利于產朊假絲酵母胞內GSH的過量合成和積累,胞內GSH含量一直高于對照;對于SAM合成,丙酮酸鈉添加的影響主要體現在細胞生長的穩(wěn)定期(12 h之后),胞內SAM含量與對照相比有較大幅度的提高。酵母胞內SAM和GSH含量的高低體現了細胞合成SAM和GSH能力的大小,丙酮酸鈉的添加提高了SAM和GSH的聯產量,不僅僅是因為促進了C.utilisSZU 07-01細胞的生長,還因為其提升了酵母細胞合成SAM和GSH的能力。以下將分別從酵母胞內SAM和GSH合成的關鍵酶活性、與能量代謝相關酶活性和物質水平的變化規(guī)律等角度對丙酮酸鈉促進SAM和GSH合成的生理機制進行探討。

圖2 產朊假絲酵母胞內SAM和GSH含量變化Fig.2 Time-course of intracellular contents of SAM and GSH in C. utilis

2.3 丙酮酸鈉促進SAM和GSH聯合高產的生理機制

2.3.1 S-腺苷蛋氨酸合成酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性 S-腺苷蛋氨酸合成酶(MAT)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)分別為酵母細胞內SAM和GSH生物合成途徑中的關鍵限速酶,MAT和γ-GCS的活性與SAM和GSH的合成速率密切相關[5-6]。為此,分別測定了SAM和GSH快速合成期時的MAT酶活(15 h和21 h)和γ-GCS酶活(9 h和15 h),結果如圖3所示。可以看出,丙酮酸鈉的添加有利于MAT和γ-GCS活性的提高。與對照相比,MAT酶活在15 h和21 h分別提高了8.1%和9.4%,γ-GCS酶活在9 h和15 h分別提高了9.7%和15.0%,這表明C.utilisSZU 07-01在丙酮酸鈉存在的情況下具有更高的合成SAM和GSH的內在動力,能實現SAM和GSH的過量合成,并最終進一步提高了SAM和GSH的聯產量。

圖3 添加丙酮酸鈉對MAT和γ-GCS活性的影響Fig.3 Effect of sodium pyruvate addition on the activities of MAT and γ-GCS注：不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),圖4、圖5同。

2.3.2 己糖激酶和異檸檬酸脫氫酶活性 己糖激酶(HK)是糖酵解途徑中的關鍵限速酶之一,其活性的高低與葡萄糖的消耗速率有著緊密的關系;異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶之一,其活性的提高有助于細胞在有氧環(huán)境中產生大量的NADH,進而為細胞代謝提供足夠的能量[20-21]。為此,分別測定了分批培養(yǎng)9 h和15 h時的HK和IDH活性,結果如圖4所示。可以看出,在細胞的快速生長期(9 h),丙酮酸鈉的添加對HK活性幾乎沒有影響,但在15 h時HK活性比對照提高了近30%,表明丙酮酸鈉可以在發(fā)酵中后期(15 h)提高酵母細胞對葡萄糖的利用能力。對于IDH來說,丙酮酸鈉添加后,其活性在9 h和15 h時均高于對照,分別提高了13.2%和43.9%。IDH活性的提高將有利于線粒體內NADH水平的增加,為能量物質ATP的合成提供更多的底物來源。

圖5 添加丙酮酸鈉對胞內NADH和ATP含量及NADH/NAD+和ATP/ADP比率的影響Fig.5 Effect of sodium pyruvate addition on intracellular levels of NADH and ATP and ratios of NADH/NAD+ and ATP/ADP

圖4 添加丙酮酸鈉對產朊假絲 酵母胞內HK和IDH活性的影響Fig.4 Effect of sodium pyruvate addition on the activities of HK and IDH in Candida utilis

2.3.3 胞內能量物質水平及其比率 ATP是生物體內重要的能量物質和輔因子,參與多種生化反應過程[22]。在酵母細胞中,ATP除了為細胞代謝提供能量之外,還是SAM和GSH生物合成的前體物質,因此胞內ATP含量及再生能力對于SAM和GSH聯合高產具有決定性的作用[10]。在好氧發(fā)酵過程中,ATP是由NADH經電子傳遞鏈氧化而形成的,故胞內NADH含量的高低可以作為ATP能否高效合成的一個重要指標。由圖1可以看出,在9 h之后SAM和GSH進入快速合成期。為此,分別測定了分批培養(yǎng)9 h和15 h時的胞內能量代謝物質(ATP、ADP、NADH和NAD+),計算出胞內NADH含量(NADH/DCW)和ATP含量(ATP/DCW)以及NADH/NAD+和ATP/ADP比率,結果如圖5所示。

可以發(fā)現,丙酮酸鈉的添加提高了發(fā)酵前期(9 h)的胞內NADH和ATP含量,其水平分別是對照的2.57倍和3.36倍。由于此時NADH/NAD+和ATP/ADP比率也明顯高于對照,說明丙酮酸鈉的存在可以顯著增加胞內ATP的供給。至15 h時,雖然丙酮酸鈉的存在能繼續(xù)將胞內NADH維持在更高的水平,但是胞內ATP含量和ATP/ADP比率明顯低于對照,說明有更多的ATP被用于細胞代謝以及SAM和GSH的生物合成中。酵母胞內較高的NADH和ATP含量為SAM和GSH的過量合成提供了更加充足的底物保障,并最終實現SAM和GSH的聯合高產。

3 結論

通過對不同培養(yǎng)時間添加不同濃度丙酮酸鈉的SAM和GSH聯產發(fā)酵結果進行分析,發(fā)現在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉可以有效地提高產朊假絲酵母生物合成SAM和GSH,分批培養(yǎng)條件下SAM和GSH的聯產量比對照提高了35.1%。對分批發(fā)酵動力學參數進行比較,發(fā)現丙酮酸鈉的添加提升了酵母細胞合成SAM和GSH的能力。酵母胞內SAM和GSH合成的關鍵酶活性、與能量代謝相關酶活性和物質水平的變化規(guī)律表明,丙酮酸鈉提高了SAM和GSH合成期的HK和IDH酶活性、MAT和γ-GCS酶活性,以及胞內能量代謝物質的水平和比率,最終實現了SAM和GSH的聯合高產。該研究結果為類似耗能合成化合物的高效生產提供了一種可行的思路。

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