三氧化二砷與組蛋白修飾模式的作用研究進展

張新宇，陳 鵬，陶宣辰

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)院普通外科，黑龍江 哈爾濱 150081

表觀遺傳學就是通過改變非基因序列從而使基因表達水平發(fā)生改變[1]，主要通過組蛋白甲基化、乙?；?、磷酸化等修飾模式的改變來發(fā)揮作用[2]，在腫瘤的發(fā)病機制研究及治療領域、表觀遺傳學的研究扮演著極其重要的角色。自其被應用于治療白血病[3]，三氧化二砷治療疾病的作用才被重視和挖掘，并開始推廣其應用于抗腫瘤、化療等[4]，但目前具體機制尚不明確，有待進一步研究。三氧化二砷攝入人體后，主要代謝的部位在肝臟，在5′-甲基化轉移酶的作用下，形成了一甲胂酸(MMOL/LA)或二甲胂酸(DMA)而被解毒[5]。在自然界中砷劑雖有三價和五價兩種形式，三價毒性高于五價，但砷劑對細胞的毒性主要看細胞對砷劑的攝入量和積累量[6]。哺乳動物三價砷劑主要通過細胞膜上水通道及上皮細胞葡萄糖轉運體來吸收，所以三價砷劑是細胞毒性的主要參與者[7]?，F階段多數國內外學者在細胞分子生物及表觀遺傳學中對三氧化二砷的抗腫瘤機制的研究主要集中在組蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化修飾上。

1 三氧化二砷與組蛋白乙?；揎椖Ｊ降母淖?/h2>

1.1組蛋白乙?；揎棇虮磉_的調控作用組蛋白的乙?；揎椩诓溉閯游锏幕虮磉_調控中發(fā)揮重要作用，其中組蛋白乙?；揎椀乃街饕峭ㄟ^乙?；D移酶和去乙?；D移酶相互作用來維持及調控的，研究[8-9]證明乙?；D移酶起主要作用。大量實驗研究表明，利用控制變量分層研究方法，利用染色質免疫沉淀技術(CHIP)、流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)、凝膠電泳(Gel electrophoresis)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或免疫印跡等證實在乙?；D移酶的作用下組蛋白乙?；皆鰪?，而基因的表達活性也相應增強，組蛋白乙酰化水平的改變直接影響染色質空間結構，進而影響著基因啟動子的表達及轉錄的開始[10-11]。這對于抑癌基因的啟動相當樂觀。

1.2三氧化二砷對細胞增殖的影響當三氧化二砷在世界范圍內被當作一種有害物質時，20世紀70年代，我國學者首次應用其與全反式維A酸治療M3型白血病取得了顯著療效，至此，這個致癌物藥理價值及其相關機制才被醫(yī)學研究員們發(fā)現，從而進行了大量的相關研究。國內外學者經過大量體內外實驗研究發(fā)現，經三氧化二砷處理后的相應細胞的增殖較對照組被明顯抑制，同時還證明抑制的程度隨三氧化二砷的濃度的提高而趨于升高[12]。相關實驗[13]還證明，三氧化二砷直接參與了細胞的凋亡過程，且不只參與一個細胞信號的傳導通路，但具體作用機制尚不明確。

1.3三氧化二砷與組蛋白乙?；揎椀南嗷プ饔猛ㄟ^細胞實驗及生化分子實驗，利用染色質免疫沉淀技術(CHIP)、流式細胞術(FCM)等證明[13]，三氧化二砷能夠增強抑癌基因的表達，抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞的凋亡[14-15]，在表觀遺傳學中缺乏相關機制研究。最近研究[16]表明，三氧化二砷對細胞內相應組蛋白表達水平的降低，很大程度是由于砷原子與組蛋白乙酰轉移酶(HAT)hMOF之間的直接結合所導致的hMOF酶活性缺失造成的。通過體外對組蛋白乙酰轉移酶活性的檢測(HAT assay)證明，三氧化二砷直接抑制hMOF的酶活性。為了證明二者的相互作用機制，利用氨基苯基氧化砷(PAPAO)與瓊脂糖凝膠樹脂交聯技術，構建出As-親和樹脂(As-activated agarose)，利用As-親和沉淀實驗證明，砷原子能直接結合hMOF。同時，采用MAIDI-TOF質譜檢測和紫外光譜吸收的實驗證明，砷原子直接結合在hMOF鋅指結構的C2HC部位。實驗[17]結果證明，三氧化二砷直接作用乙?；D移酶的鋅指結構上降低其活性，同時乙酰化轉移酶反作用三氧化二砷，降低三氧化二砷對組蛋白對應基因表達，降低其毒性。三氧化二砷對乙?；D移酶的作用力強于乙?；D移酶對三氧化二砷的作用力。三氧化二砷升高去乙酰化轉移酶的表達，但此作用并不能阻止三氧化二砷降低對應基因表達，同時去乙酰化轉移酶并不是直接影響乙?；D移酶的表達，而是間接影響。本實驗優(yōu)點：上述的實驗結論不涉及去乙化轉移酶的誤差影響，同時闡明了組蛋白乙酰修飾模式的改變與三氧化二砷的兩者相互作用，為以后探究兩者的其他相互作用提供了依據，實驗缺點：應該證明三氧化二砷是否也是直接作用去乙酰化轉移酶上而出現上述結論，同時缺少證明乙?；D移酶對三氧化二砷的反作用與三氧化二砷對去乙?；D移酶的作用是否相關。

2 三氧化二砷與組蛋白甲基化修飾模式的改變

2.1組蛋白甲基化修飾對基因表達調控的作用在表觀遺傳中組蛋白的修飾所引起染色質結構的變化，在哺乳動物的基因表達調控中發(fā)揮著重要的作用[18]，其中組蛋白甲基化修飾尤為重要。學者們利用RT-PCR、亞硫酸氫鹽PCR測序(bisulfite-sequencing PCR, BSP)、染色質免疫共沉淀(ChIP)等實驗技術，進行相關生化及細胞學實驗[19]證明，經過甲基化轉移酶處理的對應組蛋白的表達增強，而其中主要的原因是組蛋白不同修飾模式通過改變組蛋白與DNA的結合，使染色質的空間結構改變，進而改變其他轉錄因子和基因啟動子的親和性來調控基因，上述結果的出現是因為組蛋白的甲基化修飾改變了染色質的結構，使染色質變得松散而出現控制基因表達的相關基因的活性增強，從而增強了組蛋白的表達，促進細胞的增殖。同時大量的實驗研究[20]證明，抑癌基因的啟動子對應組蛋白的甲基化導致轉錄失活在表觀遺傳學中同時也是一個可逆過程，通過改變基因的高甲基化狀態(tài),進而改變基因組表達，是去甲基化治療的理論基礎[21]。

2.2三氧化二砷與組蛋白甲基化修飾模式的相互作用三氧化二砷的抗癌作用在表觀遺傳學中不僅表現在三氧化二砷對組蛋白乙?；揎椖Ｊ降母淖?，同時還表現在組蛋白甲基化修飾模式的改變上。三氧化二砷與去甲基化藥物聯合應用于體內和體外實驗，實驗[22-24]結果表明，二者聯用后的去甲基化作用增強，也證明三氧化二砷與去甲基化藥物具有協同作用。所以，三氧化二砷同時也應具有去甲基化的作用，實驗的優(yōu)點是證明了二者甲基化的機制既有相同的，即抑制甲基化轉移酶的活性而達到增強去甲基化的作用,不同在于，三氧化二砷代謝過程中可以消耗甲基的供體，而去甲基化藥物則不能通過消耗甲基供體而發(fā)揮去甲基化作用。實驗不足在于，沒有排除三氧化二砷與去甲基化轉移酶的相互作用對本實驗結果的影響。還有研究[25]表明，三氧化二砷還通過調節(jié)基因家族中的促凋亡與抗凋亡蛋白的表達活性，激活促凋亡基因使其表達增加，同時下調抗凋亡基因，此外，還可通過釋放細胞色素C途徑來使線粒體跨膜潛能喪失及促進活性氧化物的生成等途徑促進細胞凋亡。三氧化二砷還可抑制谷胱甘肽過氧化氫酶及半胱天冬酶的活性來促進凋亡。三氧化二砷在細胞內代謝會消耗S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，同時消耗甲基化轉移酶，而SAM又是細胞內甲基化轉移酶所必需的活性因子，同時SAM又是甲基生成原料，因此，上述結論有可能也發(fā)揮著去甲基化作用。綜上，三氧化二砷對腫瘤細胞的抑制作用在表觀遺傳學層面是組蛋白甲基化修飾模式中增強了組蛋白的去甲基化作用，但具體機制尚不完全清晰，這也是如今對三氧化二砷毒性作用研究的熱點。

3 三氧化二砷與組蛋白磷酸化修飾的改變

3.1組蛋白磷酸化修飾對基因表達的影響在二十世紀，組蛋白磷酸化被認為是組蛋白最常見的修飾方式，盡管組蛋白的磷酸化很難被發(fā)現。直到2009年，國外的5個獨立研究小組均發(fā)現并捕捉到組蛋白的磷酸化修飾，這一發(fā)現具有里程碑意義[26-27]。他們發(fā)現組蛋白的磷酸化修飾不僅參與細胞的損傷修復過程，而且還參與著細胞的凋亡過程，隨后研究團隊將研究拓展至腫瘤的生物學研究中，他們發(fā)現腫瘤在生物學的表達及調控中、染色質空間結構中等組蛋白的磷酸化也發(fā)生著重要變化，這對腫瘤疾病的研究開創(chuàng)了新思路。近年來，國內的學者也逐漸開始關注組蛋白磷酸化修飾，加大了對其研究的力度。國內學者也在人類多種腫瘤組織細胞中發(fā)現并證實了組蛋白磷酸化水平增高，并且發(fā)現主要集中在組蛋白H3上的相關氨基酸上，并且磷酸化的程度與腫瘤惡性程度密切相關。這些研究結果表明，組蛋白磷酸化修飾是調控細胞惡性轉化的重要表觀遺傳學改變。大量體外實驗證實，多種蛋白激酶包括RSK2(ribosomal protein S6kinase2)、MSK1(mitogen-and stress-activated kinase1)、IKK-α (IkappaB kinase-alpha)、PKC (cAMP dependent protein kinase C)、Fyn及PIM1等參與的多個信號通路調節(jié)組蛋白磷酸化水平[28]，從而誘導腫瘤基因的表達?？傮w來說，組蛋白磷酸化修飾密切參與著組織細胞有絲分裂染色體濃縮、細胞周期及基因轉錄[29]。

3.2三氧化二砷與組蛋白磷酸化修飾的作用三氧化二砷對腫瘤細胞的抑制作用眾所周知，同時組蛋白磷酸化修飾也是組織細胞在增殖及凋亡中的重要環(huán)節(jié)，所以三氧化二砷對腫瘤細胞的毒性作用與表觀遺傳中的組蛋白磷酸化修飾也是分不開的，這也是當今醫(yī)學科研工作者的一個探究方向。近期發(fā)表在《Nucleic Acids Res》雜志上的一篇論文[30]，探究三氧化二砷促進細胞凋亡中組蛋白磷酸化修飾的改變，通過采用MTT法測定藥物對細胞增殖的影響,使用瑞氏染色法觀察細胞形態(tài)學變化,流式細胞術測定細胞凋亡率,用磷酸化酶試劑盒分析藥物對細胞內磷酸化酶活性的影響，Western blotting檢測細胞內PP2A各亞基表達。實驗結果顯示，磷酸化酶抑制劑能促進三氧化二砷對腫瘤的細胞凋亡，促進三氧化二砷對腫瘤細胞的增殖抑制作用，且隨著砷劑藥物濃度增加抑制作用顯著。最終證明,三氧化二砷在抑制細胞增殖及促進細胞凋亡中，通過抑制細胞組蛋白磷酸化水平來實現自身的毒性作用。此次試驗明確證實了砷劑對組蛋白磷酸化修飾的作用，但并未具體到抑制組蛋白磷酸化的哪個通路，且對組蛋白磷酸化對砷劑的不良反應未作進一步研究，我們認為，這些都可作為日后研究的方向。上述的結論與觀點在近期國內的大量實驗后也得到了論證，但依舊缺乏更進一步的研究。

現階段的國內外學者主要集中揭開三氧化二砷對腫瘤細胞的毒性作用機制上，通過大量體內外的細胞實驗、分子實驗得出砷劑的毒理機制，目前我們的成果是豐碩的，但還有不足之處。我們認為，在實驗技術的完善及實驗設計中應加入個人的特色，敢于創(chuàng)新。未來在砷劑毒理機制表觀遺傳學研究中，應將多種修飾模式聯合研究，以便觀察各種機制相互作用。除主要修飾模式之外，組蛋白的其他修飾方式目前國內外研究甚少，不僅與表達活性難以捕捉相關，也與現階段的實驗技術及試劑的研發(fā)相關，個人認為，將來這些修飾模式在三氧化二砷的毒理作用機制中也會被發(fā)現。

綜上所述，目前在表觀遺傳學層面對三氧化二砷的毒理機制研究最熱的依舊是組蛋白的乙?；揎?，在基因的表觀遺傳組蛋白修飾模式中，乙?；揎椧彩亲顬橹匾虼酸t(yī)學成果也是最多的。其次為甲基化及磷酸化，但甲基化修飾最為常見，對組蛋白甲基化修飾的研究目前在國內較之前相比明顯提高，但目前的研究結果有待提高，不過這也為我們對抗腫瘤藥物研制，及癌癥患者治療提供了新的思路。最后，組蛋白的磷酸化修飾在基因的轉錄調控、細胞染色質凝集、細胞凋亡中起作用，目前國內對其研究相對較少，我們認為在此方面應加強力度，因為清晰的機制是藥物研制的基礎，對未來聯合抗腫瘤藥物具有重要意義，對腫瘤患者也是福音。

[1] 張順同, 孟宇, 寧怡蒙, 等. 三氧化二砷通過Akt信號通路抑制HGC-27細胞的增殖并促進其凋亡[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2017, 26(8): 910-914. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.019.

ZHANG S T, MENG Y, NING Y M, et al. Arsenic trioxide inhibits the proliferation and apoptosis of hgc-27 cells through Akt signaling pathway [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2017, 26(8): 910-914. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.019.

[2] VEAZEY K J, CARNAHAN M N, MULLER D, et al. Alcohol-induced Epigenetic Altertions to Developmentally Crucial Genes Regulating Neural Stemness and Differentiation [J]. Alcohol Clin Exp Res, 2013, 37(7): 1111-1122.DOI: 10.1111/acer.12080.

[3] 顧亞琴, 張良, 楊召聰, 等. 砷劑抗腫瘤作用研究進展[J]. 中藥藥理與臨床, 2016, 32(1): 224-227. DOI: 10.13412/j.issn.j.cnki.zyyl.2016.01.068.

[4] MARSIT C J. Influence of environmental exposure on human epigenetic regulation [J]. J Expo Biol, 2015, 218(Pt 1): 71-79. DOI: 10.1242/jeb.106971.

[5] 李述剛, 徐上知, 牛強, 等. 三氧化二砷染毒小鼠肝臟中砷甲基化水平與肝臟氧化應激的關系[J]. 環(huán)境衛(wèi)生學雜志, 2015, 5(2): 89-93, 98. DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2015.02.002.

LI S G, XU S Z, NIV Q, et al. Relationship between arsenic methylation and oxidative stress in mice liver induced Contaminated by arsenic trioxide [J]. Journal of Environmental Hygiene, 2015, 5(2): 89-93, 98. DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2015.02.002.

[6] ARITA A, SHAMY M Y, CHERVONA Y, et al. The effect of exposure to carcinogenic metals on histone tail modifications and gene expression in human subjects [J]. J Trace Elem Med Biol, 2012, 26(2-3): 174-178. DOI: 10.1016/j.jtemb.2012.03.012.

[7] LOPEZ R, SARG B, LINDNER H, et al. Linker histone partial phosp. Horylation: effects on secondary structure and chromatin condensation [J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(9): 4463-4476. DOI: 10.109/nar/gkv304.

[8] BENEDETTI R, CONTE M, ALTTUCCI L. Targeting histone deacetylases in diseases where are we?[J]. Antioxid Redox Signal, 2015, 23(1): 99-126. DOI: 10.1089/ars.2013.5776.

[9] 王凡平, 張婧婧, 房麗敏, 等. 三氧化二砷對K562細胞增殖作用的影響和機制[J]. 中國實驗血液學雜志, 2016, 24(6): 1725-1729.

WANG F P, ZHANG J J, FANG L M, et al. Effect of arsenic oxide on K562 cell proliferation and its mechanism [J]. Journal of Experimental Hematology, 2016, 24(6): 1725-1729.

[10] CHEN P J, HUANG C, MENG X M, et al. Epigenetic modifications by histone deacetylases: Biological implications and therapeutic potential in liver fibrosis [J]. Biochimie, 2015, 116: 61-69. DOI: 10.1016/j.biochi.2015.06.016.

[11] TALBERT P B, AHMAD K, ALMOUZNI G, et al. A unified phylogeny-based nomenclature for histone variants [J].Epigenetics Chromatin, 2012, 5: 7. DOI:10.1186/1756-8935-5-7.

[12] RAHMAN S, HOUSEIN Z, DABROWSKA A, et al. E2F1-mediated FOS induction in arsenic trioxide-induced cellular transformation: effects of global H3K9 hypoacetylation and promoter-specific hyperacetylation in vitro [J]. Environ Health Perspect, 2015, 123(5): 484-492. DOI:10.1289/ehp.1408302.

[13] DANGLEBEN N L, SKIBOLA C F, SMITH M T. Arsenic immunotoxicity: areview [J]. Environ Health, 2013, 12(1): 73.DOI: 10.1186/1476-069X-12-73.

[14] ZHAO B, HE T. Chidamide, a histone deacetylase inhibitor, functions as a tumor inhibitor by modulating the ratio of Bax/Bcl-2 and P2 in pancreatic cancer [J]. Oncol Rep, 2015, 33(1): 304-310. DOI: 10.3892/or.2014.3595.

[15] ZAMMATARO M, SORTINO M A, PARENTI C, et al. HDAC and HAT inhibitors differently affect analgesia mediated by group Ⅱ metabotropic glutamate receptors [J]. Mol Pain, 2014, 10: 68.DOI: 10.1186/1744-8069-10-68.

[16] LIU D, WU D L, ZHAO L, et al. Arsenic trioxide reduces global histone H4 acetylation at lysine 16 through direct binding to histone acetyl transferase hMOF in human cells [J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0141014. DOI: 10.1371/journal.pone.0141014.

[17] FANG L, WUPTRA K, CHEN D, et al. Environmental-stress-induced chromatin regulation and its heritability [J]. J Carcinog Mutagen, 2014, 5(1): 22058. DOI: 10.4172/2157-2518.1000156.

[18] 王雪瑋, 史衛(wèi)紅, 王熙才. DNA甲基化在腫瘤中的調控機制及其在肺癌中的研究進展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2017, 24(5): 558-566. DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2017.05.018.

WANG X W, SHI W H, WANG X C, et al. Regulation of DNA methylation in tumors and research progress in lung cancer [J]. Chin J Cancer Biother, 2017, 24(5): 558-566. DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2017.05.018.

[19] SHIN D, SUNG K H, KIN G Y, et al. Decitabine, a DNAmethyl transferases inhibitor, induces cell cycle arrest at G2/M phase through p53-independent pathway in human cancer cells [J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67(4): 305-311. DOI: 10.1016/j.biopha.2013.01.004.

[20] DU J, ZHOU N, LIU H, et al. Arsenic induces functional re-expression of estrogen receptor by demethylation of DNA in estrogen receptor-negative human breast cancer [J]. PLoS One, 2012, 7(4): e35957. DOI: 10.1371/journal.pone.0035957.

[21] TAIPALE M, REA S, RICHTER K, et al. MOF histone acetyltransferase is required for histone H4 lysine 16 acetylation in mammalian cells [J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(15): 6798-6810. DOI: 10.1128/MCB.25.15.6798-6810.2005.

[22] SZYMANSKI P, OLSZEWSKA P, MIKICIUK-OLASIK E, et al. Novel tetrahydroacridine and cyclopentaquinoline derivatives with fluorobenzoic acid moiety induce cell cycle arrest and apoptosis in lung cancer cells by activation of DNA damage signaling [J]. 2017, 39(3): 1010428317695011. DOI: 10.1177/1010428317695011.

[23] LI K K, LUO C, WANG D, et al. Chemical and biochemical approaches in the study of histone methylation and demethylation [J]. Med Res Rev, 2012, 32(4): 815-867. DOI: 10.1002/mrr.20228.

[24] DROBNA Z, NARANMANDURA H, KUBACHKA K M, et al. Disruption of the arsenic (+3 oxidation state) methyltransferase gene in the mouse alters the phenotype for methylation of arsenic and affects distribution and retention of orally administered arsenate [J]. Chem Res Toxicol, 2009, 22(10): 1713-1720. DOI: 10.1021/tx900179r.

[25] ZHAO B,HE T.Chidamide, a histone deacetylase inhibitor, functions as a tumor inhibitror by modulating the ratio of Bax/Bcl-2 and P21 inpancreatic cancer [J].Oncol Rep, 2015, 33(1): 304-310. DOI: 10.3892/or. 2014.3595.

[26] SINGH R K, GUNJAN A. Histone tyrosine phosphorylation comes of age [J]. Epigenetics, 2011, 6(2): 153-160.DOI: 10.4161/epi.6.2.13589.

[27] 劉寶玲, 趙園園, 于麗, 等. Ras和磷酸化ERK信號通路參與三氧化二砷逆轉耐藥作用機制的研究[J]. 中國腫瘤臨床, 2013, 40(9): 505-508, 512. DOI: 10.3969/j.issn. 1000-8179.2013.09.004.

LIU B L, ZHAO Y Y, YU L, et al. Study on the role of Ras/p-ERK signaling pathway in the reversing effect of As2O3 on multi-drug-resistance [J]. Chin J Clin Oncol, 2013, 40(9): 505-508, 512. DOI: 10.3969/j.issn. 1000-8179.2013.09.004.

[28] 徐喜慧, 歐陽建, 謝品浩, 等. 蛋白磷酸酶2A在三氧化二砷誘導NB4、MR2細胞株凋亡過程中的變化[J]. 中國實驗血液學雜志, 2008, 16(5): 1021-1025.

XU X H, OUYANG J, XIE P H, et al. Changes of activity and expression of protein phosphatase type 2A during the apoptosis of NB4 and MR2 cells induced by arsenic trioxideI [J]. Journal of Experimental Hematology, 2008,16(5): 1021-1025.

[29] 李穎, 張繼磊, 程盼盼, 等. As2O3介導彌漫大B細胞淋巴瘤細胞凋亡的JNK磷酸化機制研究[J]. 實用癌癥雜志, 2015, 30(8): 1107-1111. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5930.2015.08.001.

LI Y, ZHANG J L, CHENG P P, et al. The involvement of JNK phosphorylation in diffuse large-B cell lymphoma apoptosis mediated by As2O3[J]. The Practical Journal of Cancer, 2015, 30(8): 1107-1111. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5930.2015.08.001.

[30] LOPEZ R, SARG B, LINDNER H, et al. Linker histone partial phosphorylation: effects on secondary structure and chromatin condensation [J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(9): 4463-4476.DOI: 10.109/nar/gkv304.